一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法技术

本发明专利技术公开了一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，所述方法为：将五味子提取液与微乳液b混合，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测，获得待测样品色谱图，根据待测样品色谱图中木脂素类有效成分对应的峰面积及标准曲线，获得待测样品中木脂素类有效成分的含量；本发明专利技术采用分子筛作为吸附剂的基质固相分散萃取技术，结合微乳液电动毛细管色谱技术，能高效、环保地提取和检测五味子药材中的木脂素类有效成分含量。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种基质固相萃取技术(MSPD)和毛细管电动色谱技术(CE)的联用技术来提取分离中药五味子中木脂素类成分的分析检测方法，具体地说，它涉及由分子筛TS-1作为吸附剂，结合基质固相萃取技术和高效毛细管色谱技术，用来提取检测中药五味子中木脂素类成分含量的新方法。(二)
技术介绍
五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill的成熟果实。作为一味补益类药物，具有悠久药用历史，主要用于治疗久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、自汗、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心净失眠等症。木脂素类成分是五味子的主要活性成分，具有抗炎抗氧化、保肝、护肝、抗结肠自发收缩、抑制结肠癌细胞增殖、对短暂局灶性脑缺血神经的保护作用等活性。其中含量较高的包括五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲等。中国药典2015版将五味子醇甲作为指标性成分控制五味子药材及相关制剂的质量。但中药多成分多靶点的特性，使得学者不断致力于多成分提取及检测的新方法的开发。目前从样品前处理和检测两方面，对于五味子中木脂素类成分的提取检测方法已有很多报道。五味子的样品前处理方法主要集中在超声提取上。该方法虽然简单易行，但对目标分子的提取效率较为低下，且受基质干扰影响较大，使得分析结果相应较低。而且这一方法存在的缺陷也是显而易见：实验过程中消耗大量的有毒害的有机溶剂，既耗时又耗溶剂，且对实验操作人员身体有害，对环境污染严重。为解决上述难题，随着科技的发展，诸多新型提取方法也应运而生。其中就有基质固相分散萃取技术。基质固相分散萃取(MSPD)是建立在固相萃取基础上的一种新型样品处理技术，为近年来国内外研究的一个热门领域，已经广泛地应用于水果、蔬菜、果汁等植物样本的农药残留检测领域。当前文献报道的基质固相分散萃取技术，特别是针对天然产物领域，其吸附剂的量、药材用量以及洗脱剂的用量较大，且为有毒害的有机溶剂，对操作员的身体有害，对环境也会造成污染。而常规的基质固相分散萃取技术中，所用到的吸附剂多数以硅胶、弗罗里硅土、C18反相硅胶等为主。分子筛是指其内部具有均匀的微孔，其孔径与一般分子大小相当的一类物质。由于它孔径均匀、高比表面积、大孔体积、高吸附能力、强热稳定性等优点，故而分子筛的应用非常广泛，例如可以作选择性吸附剂、高效干燥剂、催化剂、离子交换剂等。分子筛作为吸附剂在中药活性成分的提取检测方面报道较少，是一种新颖的中药检测提取方法。而已报道的专利号CN104297026A一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法及专利号CN10456919A一种检测含中药黄芩的牙膏中黄酮类有效成分含量的方法分别以分子筛SBA-15、KIT-6为吸附剂，集中在对黄酮类成分的提取检测上。目前为止，尚未有将分子筛作为吸附剂应用于木脂素类成分的提取检测的报道。本专利技术以五味子中的木脂素类成分为示范，将分子筛TS-1引入五味子5种木脂素的提取中，可简化提取步骤，提高提取率，且可避免有机溶剂的残留。另一方面，目前五味子中木脂素类成分的分析方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用法、分光光度法等，通常以高效液相色谱法为主。该方法往往分析时间长、分离效率低，而且色谱柱容易被污染，并且色谱柱上沉积的污染物经常以杂质峰的形式出现，影响分析结果。且实验过程中使用大量有毒害的有机溶剂，对实验操作人员以及环境都造成一定的危害。毛细管电泳作为20世纪80年代以来兴起的一种新的分离分析技术，在药物分析检测中的应用日益广泛。毛细管微乳电动色谱(MEEKC)是在胶束电动毛细管色谱基础上发展起来的，以微乳液为分离介质的一种较为新型的电泳分离模式。和HPLC相比，MEEKC进样体积小(nL)、分析时间快、流动相用量少(mL)、可直接分析“脏样品”，所以MEEKC在复杂基质的中药成分分析方面具有独特优势。目前尚无文献报道微乳液毛细管电动色谱(MEEKC)法分离检测五味子的木脂素成分。综上，本专利技术建立了基于分子筛TS-1的基质分散固相萃取结合毛细管微乳电动色谱技术测定五味子五种木脂素类成分的含量，以期为五味子药材的质量控制提供一种更加绿色、简便、快速、高效的新方法。(三)
技术实现思路
本专利技术目的在于寻求一种比常规方法更快速更绿色环保的五味子木脂素提取及含量测定方法。本专利技术创造性地将基质固相分散萃取技术和微乳液电动毛细管色谱技术结合，分子筛作为基质固相分散萃取的吸附剂与基质固相分散混合物中的目标分子吸附结合，从而使得目标分子从复杂基质中分离出来，得到含有目标分子的洗脱液。洗脱液采用MEEKC进行分离检测。MEEKC所分离的物质的极性范围很宽，可以同时分离水溶性、脂溶性、带电或不带电的物质。且本专利技术在一个微量体系中实施，所用药材以及实验药品试剂均在微克级别，有害化学试剂使用量少，安全，经济，环保。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，所述木脂素类有效成分为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素，所述方法为：(1)提取：将五味子与吸附剂混合，粉碎，获得五味子混合粉末，将五味子混合粉末用固相萃取柱进行洗脱，加入洗脱剂，收集流出液，离心，取上清液即为五味子提取液，生药量为25-50mg/ml；所述吸附剂为下列之一：分子筛TS-1、硅藻土、中性Al2O3、硅胶或C18；所述洗脱剂为下列一种或两种的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯；(2)标准曲线：将五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品用无水甲醇配制成混合对照品溶液母液，将混合对照品溶液母液用微乳液a梯度稀释成若干份混合对照品溶液试样，通过微乳液电动毛细管色谱法(MEEKC)进行检测，获得混合对照品色谱图，以混合对照品溶液试样中各个单一对照品进样浓度为横坐标，以色谱图中各个单一对照品各自对应的峰面积为纵坐标，制备标准曲线；所述微乳液a体积终浓度组成为：表面活性剂0.2％～1.2％(w/v，这里是指1mL微乳液中含有0.2-1.2g表面活性剂)、辅助表面活性剂1～6％(v/v)、油相0.5～1％(v/v)、有机添加剂0％～14％(v/v)，溶剂为pH9、5～30mmol/L硼砂缓冲液；所述表面活性剂为下列之一：十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸钠、聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(吐温-20)或月桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)；所述辅助表面活性剂为下列之一：正丁醇、异丙醇或正丙醇；所述油相为乙酸乙酯，所述有机添加剂为乙腈；所述混合对照品溶液母液中五味子醇甲终浓度0.04-1.0mg/mL、五味子醇乙终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子酯甲终浓度0.01-0.2mg/mL、五味子甲素终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子乙素终浓度0.04-1.0mg/mL；优选所述混合对照品溶液母液中五味子醇甲终浓度0.242mg/mL、五味子醇乙终浓度0.100mg/mL、五味子酯甲终浓度0.044mg/mL、五味子甲素终浓度0.124mg/mL、五味子乙素终浓度0.204mg/mL；(3)检测：将步骤(1)五味子提取液与微乳液b混合，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，所述木脂素类有效成分为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素，其特征在于所述方法为：(1)提取：将五味子与吸附剂混合，粉碎，获得五味子混合粉末，将五味子混合粉末用固相萃取柱进行洗脱，加入洗脱剂，收集流出液，离心，取上清液即为五味子提取液；所述吸附剂为下列之一：分子筛TS‑1、硅藻土、中性Al2O3、硅胶或C18；所述洗脱剂为下列一种或两种的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯；(2)标准曲线：将五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品用无水甲醇配制成混合对照品溶液母液，将混合对照品溶液母液用微乳液a梯度稀释成若干份混合对照品溶液试样，通过微乳液电动毛细管色谱法进行检测，获得混合对照品色谱图，以混合对照品溶液试样中各个单一对照品进样浓度为横坐标，以色谱图中各个单一对照品各自对应的峰面积为纵坐标，制备标准曲线；所述微乳液a体积终浓度组成为：表面活性剂0.2‑1.2％、辅助表面活性剂1～6％、油相0.5～1％、有机添加剂0％～14％，溶剂为pH 9、5～30mmol/L硼砂缓冲液；所述表面活性剂为下列之一：十二烷基硫酸钠、胆酸钠、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯或月桂醇聚氧乙烯醚；所述辅助表面活性剂为下列之一：正丁醇、异丙醇或正丙醇；所述油相为乙酸乙酯，所述有机添加剂为乙腈；所述混合对照品溶液母液中五味子醇甲终浓度0.04‑1.0mg/mL、五味子醇乙终浓度0.02‑0.5mg/mL、五味子酯甲终浓度0.01‑0.2mg/mL、五味子甲素终浓度0.02‑0.5mg/mL、五味子乙素终浓度0.04‑1.0mg/mL；(3)检测：将步骤(1)五味子提取液与微乳液b混合，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测，获得待测样品色谱图，根据待测样品色谱图中木脂素类有效成分对应的峰面积及标准曲线，获得待测样品中木脂素类有效成分的含量；所述微乳液b组成同微乳液a；所述微乳液b与五味子提取液体积比为1‑10:1。...

【技术特征摘要】
1.一种五味子中木脂素类有效成分的提取检测方法，所述木脂素类有效成分为五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素，其特征在于所述方法为：(1)提取：将五味子与吸附剂混合，粉碎，获得五味子混合粉末，将五味子混合粉末用固相萃取柱进行洗脱，加入洗脱剂，收集流出液，离心，取上清液即为五味子提取液；所述吸附剂为下列之一：分子筛TS-1、硅藻土、中性Al2O3、硅胶或C18；所述洗脱剂为下列一种或两种的混合：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯；(2)标准曲线：将五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品用无水甲醇配制成混合对照品溶液母液，将混合对照品溶液母液用微乳液a梯度稀释成若干份混合对照品溶液试样，通过微乳液电动毛细管色谱法进行检测，获得混合对照品色谱图，以混合对照品溶液试样中各个单一对照品进样浓度为横坐标，以色谱图中各个单一对照品各自对应的峰面积为纵坐标，制备标准曲线；所述微乳液a体积终浓度组成为：表面活性剂0.2-1.2％、辅助表面活性剂1～6％、油相0.5～1％、有机添加剂0％～14％，溶剂为pH9、5～30mmol/L硼砂缓冲液；所述表面活性剂为下列之一：十二烷基硫酸钠、胆酸钠、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯或月桂醇聚氧乙烯醚；所述辅助表面活性剂为下列之一：正丁醇、异丙醇或正丙醇；所述油相为乙酸乙酯，所述有机添加剂为乙腈；所述混合对照品溶液母液中五味子醇甲终浓度0.04-1.0mg/mL、五味子醇乙终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子酯甲终浓度0.01-0.2mg/mL、五味子甲素终浓度0.02-0.5mg/mL、五味子乙素终浓度0.04-1.0mg/mL；(3)检测：将步骤(1)五味子提取液与微乳液b混合，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测，获得待测样品色谱图，根据待测样品色谱图中木脂素类有效成分对应的峰...

【专利技术属性】
技术研发人员：楚楚，郑丽琼，魏蒙蒙，颜继忠，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33