多功能标签融合蛋白及其表达方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种多标签融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化方法。所述多标签融合蛋白从N端到C端包括：His，Trx，3×FLAG，GST，strep(II)，HA，GFP，cMyc，His中的两种以上的蛋白标签。本发明专利技术选用的多功能标签的编码基因序列兼顾了各标签的功能、大小和插入的位点对目的蛋白的影响，多标签融合蛋白的排列顺序及插入位点的选择有利于多功能标签蛋白的高效表达；多标签串联的方式，有利于采用两种以上的纯化标签中进行两步或多步法纯化，以产生高纯蛋白。由此可见，本发明专利技术的融合蛋白不仅表达量较高，纯度高，并且融合蛋白中所串联的各个蛋白标签都具有生物学活性，可作为含有多标签融合蛋白中一种或多种其他融合蛋白定性或定量检测时的阳性对照，测试检测系统的适用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程基因领域，涉及一种多标签融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化方法。
技术介绍
蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。目的蛋白与蛋白标签以融合形式表达，因此根据蛋白标签开发出来的特异性抗体可以用来进行目的蛋白的示踪、检测。在研究中通过蛋白标签特异性抗体检测融合有相应蛋白标签的目的蛋白一般采用western-blot、ELISA、点杂交、免疫荧光等方法，而在上述检测方法中加入标准的蛋白标签抗原作为阳性对照确定了检测系统的适用性及可用性，提高了检测结果的可信度。目前，市场上已有多种针对不同蛋白标签的抗体可供选择，而相应的标准蛋白标签产品则很少，并且如果研究范围包括多种不同蛋白标签的融合蛋白即需要购买多种标签蛋白作为阳性对照。因此如果提供一种融合有多种常见蛋白标签的通用型蛋白标签对照抗原，一方面可以为相关研究提供真实有效地对照，另一方面可以减少购买多个蛋白标签抗原对照品的成本。在构建多标签融合蛋白中，关键问题在于多标签融合蛋白在表达载体中的插入位点、各标签的排列顺序以及各标签的链接肽等因素均会影响各标签蛋白的折叠、稳定性以及多标签融合蛋白的成功表达。同时，上述因素的选择对多标签融合蛋白中各标签的高级结构的形成以及整体多标签融合蛋白的表达量也至关重要，并且随多标签蛋白中标签蛋白数目的增加，融合蛋白的分子量也越大，在大肠杆菌表达系统中越难以表达出稳定的有活性的多标签融合蛋白。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种同时串联多种标签蛋白的融合蛋白，并通过密码子优化的方法，适合该融合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性和纯化的方法。本专利技术第一个目的是提供一种串联了多种蛋白标签的融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端包括：His、Trx、3×FLAG、GST、Strep、HA、GFP、cMyc中的两种以上的蛋白标签。优选的，所述融合蛋白从N端到C端由His、Trx、3×FLAG、GST、Strep、HA、GFP、cMyc、His蛋白标签直接串联组成。更优选的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID：1所示。本专利技术采用的英文缩写、中文释义，蛋白序列或Genebank登录号分如下：His：本专利技术采用的组氨酸标签的氨基酸序列为:HHHHHH；cMyc：本专利技术采用的c-Myc标签的的氨基酸序列为:EQKLISEEDL；3×Flag：本专利技术采用的Flag标签的氨基酸序列为DYKDDDDKDYKDDDDKDYKDDDDK；HA：本专利技术采用的HA标签的氨基酸序列为YPYDVPDYA；Strep:本专利技术采用的Strep标签的氨基酸序列为WSHPQFEK；Trx:硫氧还蛋白标签,本专利技术采用的Trx标签的Genebank登录号为AAN83133.1；GST：谷胱甘肽S-转移酶标签，本专利技术采用的GST标签的Genebank登录号为：WP_008430144.1；GFP：绿色荧光蛋白标签，本专利技术采用的GFP标签的Genebank登录号为：AAB51347.1。本专利技术还提供了编码上述多标签融合蛋白(记为ZHB-tag)的DNA序列，如SEQID：2所示，该序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，更适于大肠杆菌系统表达。本专利技术还提供了包含上述DNA序列的表达载体，所述载体优选为pET21b。本专利技术还提供了一种含有上述表达载体的大肠杆菌菌株，优选的大肠杆菌菌株为BL21(DE3)。本专利技术还提供了一种用于上述融合蛋白包涵体复性和纯化的方法，其步骤如下：步骤1、将经预冷的PBS清洗沉淀得到的含有诱导ZHB-tag的大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min；步骤2、吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(菌体湿重)加入裂解缓冲液BufferA5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起；步骤3、每克(菌体湿重)菌体加入5μL100mmol/LPMSF，5μL100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min；步骤4、用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min；步骤5、沉淀用洗涤缓冲液BufferB洗涤，4℃，12000rpm，离心15min，沉淀包涵体，重复一次；步骤6、包涵体沉淀用变性缓冲液BufferC溶解，室温下搅拌30min；步骤7、充分混匀后室温12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清，即得到ZHB-tag变性溶液；步骤8、采用BufferD进行稀释复性法对步骤7中的ZHB-tag的变性溶液复性；步骤9、主要采用IMAC亲和层析分离纯化ZHB-tag复性液，柱子选择为HisTrapFFcrude；步骤10、将所述融合蛋白纯化后样品使用截留分子量为50KDa的透析袋在PBS缓冲液中透析，每6h换液一次，共换液3-4次，收集透析液，真空冷冻干燥得到最终的所述融合蛋白纯品。本专利技术提供了编码上述融合蛋白的基因，该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。此外，本专利技术选用的多功能标签的编码基因序列兼顾了各标签的功能、大小和插入的位点对目的蛋白的影响，多标签融合蛋白的排列顺序及插入位点的选择有利于多功能标签蛋白的高效表达；此外，多标签串联的方式，有利于采用两种以上的纯化标签中进行两步或多步法纯化，以产生高纯蛋白。因此，本专利技术提供的多标签融合蛋白不仅实现了在大肠杆菌表达系统中大分量融合蛋白的成功表达，并且所表达的多标签融合蛋白中各标签蛋白依然具备其原本的生物学活性。另一方面，本专利技术提供了一种多标签融合蛋白在蛋白质的表达、示踪、纯化、和检测中的应用。本专利技术提供的一种多标签融合蛋白及其构建方法和应用具有如下有益效果：(1)所述通用型重组表达载体携带多个常用蛋白质标签(HIS，Trx，3×FLAG，GST，Strep，HA，GFP和cMyc中的至少一种)的编码基因，可用于对目的蛋白进行可溶性表达、并便于纯化和检测；(2)所述通用型重组表达载体携带多个常用蛋白质标签(HIS，Trx，3×FLAG，GST，Strep，HA，GFP、cMyc、HIS)的编码基因表达出的融合蛋白，可用于研发工作中含有HIS，Trx，3×FLAG，GST，Strep，HA，GFP和cMyc至少一种的其他融合蛋白蛋白检测的阳性对照。附图说明图1表示ZHB-tag密码子优化前后核苷酸序列比较其中，奇数行(即“原始序列”对应的行)为ZHB-tag核苷酸序列，即密码子优化前的序列；偶数行(即“优化序列”对应的行)为本专利技术的ZHB-tag核苷酸序列，即密码子优化后的序列。图2-a、图2-b为ZHB-tag密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数。其中，图2-a表示ZHB-tag核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.62；图2-b表示优化后的本专利技术的ZHB-tag密码子在大肠杆菌表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端包括：His、Trx、3×FLAG、GST、Strep、HA、GFP、cMyc中的两种以上的蛋白标签。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端包括：His、Trx、3×FLAG、GST、Strep、HA、GFP、cMyc中的两种以上的蛋白标签。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端由His、Trx、3×FLAG、GST、Strep、HA、GFP、cMyc、His蛋白标签直接串联组成。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID：1所示。4.一种权利要求2所述融合蛋白的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO：2所示。5.一种含有如权利要求4所述基因的载体。6.根据权利要求5所述的载体，所述载体为pET21b。7.一种含有权利要求5或6所述载体的大肠杆菌菌株。8.根据权利要求7所述的大肠杆菌菌株，所述菌株为BL21(DE3)。9.一种融合蛋白的包涵体复性和纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1、将IPTG诱导表达的权利要求8所述的大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min；步骤2、吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(菌体湿重)加入裂解缓冲液BufferA5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起；步骤3、每克(菌体湿重)菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，王安良，赵百学，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32