多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测志贺菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测志贺菌的方法，所述方法在多交叉置换恒温扩增中的交叉引物CP1或CP2的5’端标记半抗原，D1或D2的5’端标记生物素，所述方法针对志贺菌ipaH的多交叉置换恒温扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种恒温扩增微生物目的基因的方法，属于微生物和分子生物学

技术介绍
志贺菌(Shigellaspp.)是一类革兰阴性杆菌，根据群特异性的O抗原，分为四个血清群。A群:又称痢疾志贺菌(S.dysenteriae)，通称志贺痢疾杆菌；B群：又称福氏志贺菌(S.flexneri)，通称福氏痢疾杆菌；C群：又称鲍氏志贺菌(S.boydii)，通称鲍氏痢疾杆菌；D群：又称宋内志贺菌(S.sonnei)，通称宋内痢疾杆菌。志贺菌广泛存在于环境中，常分离自食品样本及临床标本，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。志贺菌作为一种重要的食源性疾病病原体，主要通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。传染源主要为病人和带菌者,人类对志贺菌易感，10～200个细菌可致病。志贺菌导致的细菌性痢疾是最常见的肠道传染病，夏秋两季患者最多。临床症状表现为发热、腹痛、腹泻。据WHO数据统计，全球每年有167万病人死于由志贺菌导致的腹泻，从而受到全球卫生部门的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。无论是在发展中国家还是发达国家，志贺菌是引起菌痢的最主要的病原体。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，开展食源性病原体监测以及志贺菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的诊断方法，能够快捷、敏感、特异地鉴定志贺菌成为必要。目前对于志贺菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括增菌、选择培养及后续的生化鉴定，其劣势耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于志贺菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，从而限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断志贺菌的PCR方法和Real-timePCR方法，诊断灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性，便捷性，可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，在生物、农业、医学等领域实现便捷、快速、敏感及特异地扩增核酸序列，专利技术人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(MultipleCrossDisplacementAmplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。在本专利技术中，为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济，专利技术人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术、实现快速，敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸诊断技术(Visualandmultiplexdetectionofnucleicacidsequencebymultiplecrossdisplacementamplificationcoupledwithgoldnanoparticle-basedlateralflowbiosensor，MCDA-LFB)，并将该技术运用于志贺菌的检测。本专利技术针对志贺菌的特异基因ipaH设计一套MCDA扩增引物，旨在验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对志贺菌病原体的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种应用多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*；(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，同时提供在扩增引物D1或D2的5’端标记有生物素的扩增引物D1*或D2*；(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。在一个优选的技术方案中，在所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端所标记的半抗原为荧光素。在一个更为优选的技术方案中，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。在一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在60-67℃的环境中进行的。在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在65℃的环境中进行的。在一个优选的技术方案中，所述目的基因为志贺菌的ipaH。优选地，所述置换引物F1的序列如SEQIDNO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQIDNO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQIDNO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQIDNO:6所示，引物C1的序列如SEQIDNO:7所示，引物C2的序列如SEQIDNO:8所示，引物D1的序列如SEQIDNO:9所示，引物D2的序列如SEQIDNO:11所示，引物R1的序列如SEQIDNO:12所示，引物R2的序列如SEQIDNO:13所示。本专利技术在另一方面还提供了一组用于恒温扩增志贺菌ipaH基因的引物序列，所述序列包括：如SEQIDNO:1所示的置换引物F1，如SEQIDNO:2所示的置换引物F2，如SEQIDNO:3所示的交叉引物CP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*；(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，其中，同时提供在扩增引物D1或D2的5’端标记有生物素的扩增引物D1*或D2*；(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。...

【技术特征摘要】
1.一种应用多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有与序列C2s互补的序列C2和序列P2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有半抗原的交叉引物CP1*或CP2*；(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，含有与序列C2s互补的扩增引物C2，含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2，其中，同时提供在扩增引物D1或D2的5’端标记有生物素的扩增引物D1*或D2*；(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述交叉引物CP1*或CP2*的5’端所标记的半抗原为荧光素。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶长芸，王毅，王艳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11