一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用，编码嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，该嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ]修饰的CIK可用于B细胞淋巴瘤白血病的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物与新医药
，公开了一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用。
技术介绍
肿瘤的发病率逐年上升，恶性肿瘤已严重危害人类健康。目前肿瘤治疗手段却仍未取得实质性的进展，当今肿瘤的治疗手段还停留在传统的手术切除、化疗和放疗等方法。部分中晚期患者手术切除虽可以去除肿瘤病灶，但对转移病灶效果不佳，而放疗、化疗除对病变组织外，对正常组织也会造成损伤，给病人带来较大的伤害，目前恶性肿瘤的死亡率仍居高不下。因此，人们力图寻找更为稳妥有效的治疗对策，其中，通过已鉴定的肿瘤特异性抗原为基础进行肿瘤免疫治疗已成为当今肿瘤治疗的研究热点。B细胞淋巴瘤，通常发生于儿童和成年人，是一种攻击免疫系统中B细胞的癌症类型，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其中，经典的霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞淋巴瘤起源于B细胞的肿瘤。肿瘤由融合成片的多形性瘤细胞组成，多形性细胞类似HL中的陷窝细胞和H细胞，病变内有些区域似CHL，另一些区域似DLBCL2间质弥漫或局灶性纤维化，炎症性背景通常不明显，坏死较常见。CD19是诊断B淋巴细胞系肿瘤和鉴定B淋巴细胞的最好标志，是典型的I型跨膜糖蛋白，拥有一个胞内C-端和胞外N-端。在正常的淋巴组织中，CD19位于生发中心细胞(B细胞和滤泡树突状细胞)、套区细胞和滤泡间散在的细胞，整体的染色方式类似于CD20和CD22，但是与后两者不同的是，CD19也表达于前B细胞，但不在成熟浆细胞中表达。在B细胞肿瘤组织中，CD19阳性见于绝大多数的B细胞中路，浆细胞淋巴瘤以及T细胞肿瘤阴性。Masir的研究表明，CD19在14％弥漫性大B细胞淋巴瘤、30％的T细胞丰富的B细胞淋巴瘤和75％的移植后B淋巴增值性疾病中阴性，在经典霍奇金病中的R-S细胞亦不表达。它主要作为B细胞共受体与CD21和CD81结合，经激活后，CD19的细胞质部分磷酸化，与Src链激素酶类结合。CD19作为一种重要的信号转导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体和其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原.CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞，cytokine-inducedkiller)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极少，仅1％～5％。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和非MHC限制性杀瘤优点。CIK通过三种途径杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞：(1)CIK对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤，通过释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。(2)CIK释放的大量炎性细胞因子(如FN-γ、TNF-α、IL-2等)具有抑瘤杀瘤活性，还可以通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。(3)CIK细胞在培养过程中表达FasL(II型跨膜糖蛋白)通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(I型跨膜糖蛋白)结合，诱导肿瘤细胞的凋亡。相对与普通的T淋巴细胞，CIK具有以下优势：CIK细胞增值速度快；CIK具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用；杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗；典型的个性化生物治疗模式，通过转基因T细胞受体(Tcellreceptors，TCRs)和表达嵌合抗原受体(chimericantigenreceptors)等基因工程方法改良CIK，可对肿瘤进行精准杀伤；由于CIK是活化的自体细胞，使用安全。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)是模拟T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)功能的人工受体，由抗原识别结构域(单链抗体)和CIK细胞的一系列信号结构域(CD3，CD58)依次连接而成。根据胞内信号结构含有的结构域不同，CAR被划分为三代。第一代CAR蛋白的胞内域仅含有一个媒介TCR信号的CD3ζ或FcRγ。为增强CAR修饰T淋巴细胞在体内的增值和存活能力，一些共刺激分子(如CD28或4-1BB)的胞内信号结构域被加入到第一代CAR中，形成第二代CAR(含有一个共刺激分子)和第三代CAR(含有两个共刺激分子)，从而使激活T细胞的效率更高。CAR修饰的CIK能够通过其抗原识别结构域(单链抗体)识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过胞内信号结构域将识别信号传递到胞内，激活CIK的杀伤活性，杀死肿瘤细胞。CAR修饰的CIK治疗肿瘤，是一种利用人体自身或者直系亲属淋巴细胞诱导得到CIK，并对其修饰，使其能够识别肿瘤细胞进行精准杀伤的治疗手段。相对于目前临床使用的放疗、化疗而言，具有毒副作用小的特点。由于CAR修饰的CIK通过其CAR的抗原识别结构域识别肿瘤细胞，然后启动杀伤作用，因此具有靶向性的特点；由于CAR修饰的CIK通过CAR的抗原识别结构域直接识别肿瘤细胞表面抗原，并通过来源于CD8、CD28、CD137和CD3ζ的信号结构域直接将识别信号传递至胞内，激活CIK的杀伤活性，因此可以绕开常规免疫的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)的限制性。
技术实现思路
为了弥补以上不足，本专利技术提供了一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用。本专利技术的方案是：一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法：将人源化抗人B细胞淋巴瘤抗原CD19的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK。作为优选的技术方案，所述的编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。作为优选的技术方案，所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下操作：所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒转染293T细胞后，所述293T细胞释放慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK。作为优选的技术方案，所述患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下制取：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率；当CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率&本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于：将人源化抗人B细胞淋巴瘤抗原CD19的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区、4‑1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ修饰的CIK。

【技术特征摘要】
1.一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于：将人源化抗人B细胞淋巴瘤抗原CD19的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK。2.如权利要求1所述的一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于：所述的编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于，所述患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下制取：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率；当CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明录，万磊，李言志，冯健海，金海峰，强邦明，张传鹏，
申请(专利权)人：山东兴瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37