本发明专利技术涉及猪链球菌血清型2型保护性抗原蛋白的专用培养基即应用。采用高密度发酵工艺，对供试菌发酵中菌体生长、基质消耗、次级代谢产物、动态平衡及内在规律进行了系统研究，优化了发酵培养基成分、发酵培养条件和发酵工艺。通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、响应面分析等优化专用培养基，保证供试菌在一定比生长速率下菌体正常生长代谢，得到较高菌体量，又能使猪链球菌血清型2型保护性抗原蛋白的表达量显著提高，满足大规模生产要求。本发明专利技术的培养基在发酵终点菌体量可达250g/L，每升发酵液中蛋白表达量可达20.9g，比传统TSB培养基中同类蛋白表达量提高了四倍，发酵成本降低了近50％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业微生物
，具体涉及猪链球菌血清型2型保护性抗原蛋白的专用培养基及应用。本专利技术专用培养基可应用于高密度高表达培养重组大肠杆菌产胞内HP0197蛋白(猪链球菌血清型2型新型的保护性表面抗原和毒力相关蛋白)，适用于猪链球菌血清型2型保护性抗原蛋白(疫苗)的大量制备。
技术介绍
猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种重要的细菌性猪源病原，其常给全球的养猪业造成巨大损失。当感染S.suis后，病猪通常会出现脑膜炎，关节炎，心内膜炎，以及败血症等症状。该菌按照血清型的不同，可分为33个血清型，其中猪链球菌血清型2型(Streptococcussuisserotype2,SS2)在世界范围内被广泛报道为最主要的致病性血清型，而且S.suis也是一种重要的人畜共患病病原。随着对猪链球菌2型的毒力因子及其基因组成研究的不断深入，基因工程疫苗的开发对于猪链球菌2型引起的猪链球菌病的预防与控制有着重要的意义。本专利技术的供试菌株是一株重组大肠杆菌BL21/pET-28a-0197(该菌株分泌猪链球菌2型0197蛋白，又称HP0197蛋白)。对HP0197蛋白进行鉴定(袁增智等.猪链球菌毒力相关蛋白HP0197的结构生物学研究以及喹诺酮耐药相关基因突变研究[D].华中农业大学)，结果是：猪链球菌保护性抗原HP0197蛋白确为猪链球菌血清型2型新型的保护性表面抗原和毒力相关蛋白。一般情况下，蛋白的表达量与大肠杆菌发酵密度密切相关，大肠杆菌的收率直接关系到目的蛋白的得率。HP0197蛋白作为该供试菌株表达的异源蛋白未能分泌至胞外，而是以包涵体的形式存在于菌体胞内，因此，为提高重组蛋白得率、降低培养体积、提升下游操作效率以及减少设备投入，本专利技术通过应用高密度发酵技术，对供试的重组大肠杆菌菌株BL21/pET-28a-0197(重组大肠杆菌菌株BL21/pET-28a-0197菌株来源参见：金梅林等，一种猪链球菌2型三组分亚单位疫苗及应用，中国专利技术专利，专利号ZL2008102253466)进行大规模培养，着重研究其发酵过程中菌体生长、基质消耗、次级代谢产物乙酸的生成、动态平衡及其内在规律等，确定控制发酵代谢的抑制性因素和限制性因素，实现对其发酵代谢过程的调节和控制，优化发酵培养基成分、发酵培养条件和发酵工艺，并进行中试放大及产业化放大研究，实现该供试菌株的高密度高表达发酵培养。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供适用于一种重组大肠杆菌高密度高表达猪链球菌血清型2型保护性抗原蛋白的培养基。该培养基为全合成培养基，不仅营养成分含量准确，可重复性强，能够降低大规模发酵及后处理的操作难度，而且大大减少了大规模生产的成本。最关键的是本专利技术的培养基配方是适合于生产猪链球菌血清型2型新型的保护性抗原的专用培养基，无论菌体量还是蛋白表达量都能得到显著提高。相对于其他的半合成培养基或天然培养基，本专利技术的全合成培养基的配制亦是发酵成功的关键点之一。在考虑操作可行性的前提下，需按其不同成分的化学性质进行配制、灭菌、添加，以达到稳定有效的发酵利用。本专利技术是针对产胞内猪链球菌血清型2型新型的保护性抗原HP0197蛋白的重组大肠杆菌所设计的高密度高表达发酵培养基配方。通过单因素方法、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验、响应面方法优化的全合成专用培养基既能保证供试菌株在一定的比生长速率情况下菌体生长代谢正常，得到较高的菌体量，又能使HP0197蛋白的表达量得到显著提高，完全可以满足大规模生产的要求。本专利技术的培养基在发酵终点菌体量可达250g/L，每升发酵液的蛋白表达量可达20.9g，比常用商业培养基TSB培养基蛋白表达量提高了四倍，而发酵生产成本降低了近50％。通过蛋白质印迹法分析目的蛋白占粗提蛋白质的82％。实现本专利技术目的的具体技术方案如下：一种猪链球菌(streptococcussuis)血清型2型的保护性抗原蛋白的专用培养基，包括通过下列步骤制备得到：按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO45～15g/L，K2HPO41～5g/L，(NH4)2SO41～10g/L，MgSO4·7H2O1～10g/L，EDTA5～15mg/L，MnSO4·5H2O1～15mg/L，CoCl2·6H2O1～15mg/L，CuSO4·5H2O1～15mg/L，H3BO41～15mg/L，Na2MoO4·2H2O1～15mg/L，ZnCl21～10mg/L，柠檬酸铁10～200mg/L和生物素1～15mg/L，余量是水。培养基的pH值为自然培养基(即不用调整)。本专利技术的优选方案之一在于，按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO46～9g/L，K2HPO42～3g/L，(NH4)2SO43～7g/L，MgSO4·7H2O2～6g/L，EDTA6～10mg/L，MnSO4·5H2O1.5～8mg/L，CoCl2·6H2O3～7mg/L，CuSO4·5H2O2～6mg/L，H3BO42～5mg/L，Na2MoO4·2H2O3～10mg/L，ZnCl22～6mg/L，柠檬酸铁100～175mg/L和生物素5～13mg/L，余量是水。该培养基的pH值为自然pH(即不作调整)。本专利技术的优选方案之二在于，按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO48.7g/L，K2HPO42.2g/L，(NH4)2SO43.5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，EDTA9.2mg/L，MnSO4·5H2O2.4mg/L，CoCl2·6H2O3.7mg/L，CuSO4·5H2O3mg/L，H3BO42.5mg/L，Na2MoO4·2H2O2.2mg/L，ZnCl22mg/L，柠檬酸铁200mg/L和生物素10mg/L，余量是水。该培养基的pH值为自然pH(即不作调整)。申请人提供了一种猪链球菌(streptococcussuis)血清型2型的保护性抗原蛋白的专用培养基的制备方法，包括下列步骤：按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO45～15g/L，K2HPO41～5g/L，(NH4)2SO41～10g/L，MgSO4·7H2O1～10g/L，EDTA5～15mg/L，MnSO4·5H2O1～15mg/L，CoCl2·6H2O1～15mg/L，CuSO4·5H2O1～15mg/L，H3BO41～15mg/L，Na2MoO4·2H2O1～15mg/L，ZnCl21～10mg/L，柠檬酸铁10～200mg/L和生物素1～15mg/L，余量是水。该培养基的pH值为自然pH(即不作调整)。作为优选方案之一，按下列步骤：按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO46～9g/L，K2HPO42～3g/L，(NH4)2SO43～7g/L，MgSO4·7H2O2～6g/L，EDTA6～10mg/L，MnSO4·5H2O1.5～8mg/L，CoCl2·6H2O3～7mg/L，CuSO4·5H2O2～6mg/L，H3BO42～5mg/L，Na2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪链球菌(streptococcus suis)血清型2型的保护性抗原蛋白的专用培养基，其特征在于，所述的培养基通过下列步骤制备得到：按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO4 5～15g/L，K2HPO4 1～5g/L，(NH4)2SO4 1～10g/L，MgSO4·7H2O 1～10g/L，EDTA 5～15mg/L，MnSO4·5H2O 1～15mg/L，CoCl2·6H2O 1～15mg/L，CuSO4·5H2O 1～15mg/L，H3BO4 1～15mg/L，Na2MoO4·2H2O 1～15mg/L，ZnCl2 1～10mg/L，柠檬酸铁10～200mg/L和生物素1～15mg/L，余量是水。
【技术特征摘要】
1.一种猪链球菌(streptococcussuis)血清型2型的保护性抗原蛋白的专用培养基，其特征在于，所述的培养基通过下列步骤制备得到：按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO45～15g/L，K2HPO41～5g/L，(NH4)2SO41～10g/L，MgSO4·7H2O1～10g/L，EDTA5～15mg/L，MnSO4·5H2O1～15mg/L，CoCl2·6H2O1～15mg/L，CuSO4·5H2O1～15mg/L，H3BO41～15mg/L，Na2MoO4·2H2O1～15mg/L，ZnCl21～10mg/L，柠檬酸铁10～200mg/L和生物素1～15mg/L，余量是水。2.如权利要求1所述的一种猪链球菌(streptococcussuis)血清型2型的保护性抗原蛋白的专用培养基，其特征包括，所述的培养基通过下列步骤制备得到：按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO46～9g/L，K2HPO42～3g/L，(NH4)2SO43～7g/L，MgSO4·7H2O2～6g/L，EDTA6～10mg/L，MnSO4·5H2O1.5～8mg/L，CoCl2·6H2O3～7mg/L，CuSO4·5H2O2～6mg/L，H3BO42～5mg/L，Na2MoO4·2H2O3～10mg/L，ZnCl22～6mg/L，柠檬酸铁100～175mg/L和生物素5～13mg/L，余量是水。3.如权利要求1所述的一种猪链球菌(streptococcussuis)血清型2型的保护性抗原蛋白的专用培养基，其特征包括，所述的培养基通过下列步骤制备得到：按重量/体积计的组分如下：葡萄糖10g/L，KH2PO48.7g/L，K2HPO42.2g/L，(NH4)2SO43.5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，EDTA9.2mg/L，MnSO4·5H2O2.4mg/L，CoCl2·6H2O3.7mg/L，CuSO4·5H2O3mg/L，H3BO42.5mg/L，Na2MoO4·2H2O2.2mg/L，ZnCl22mg/L，柠檬酸铁200mg/L和生物素10mg/L，余量是水。4.一种猪链球菌(streptococcussuis)血清型2型的保护性抗原蛋白的专...
【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，杨欢欢，康超，石建，韩进，孙小美，
申请(专利权)人：武汉科缘生物发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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