通过降低RNA干扰来提高真核细胞中的转基因表达制造技术

本发明专利技术描述了用于通过降低RNA干扰(RNAi)来提高真核细胞中的转基因表达的方法，以及由所述方法制备的变体细胞。所述方法和变体细胞可用于例如由真核细胞高效制备治疗用多肽和工业用多肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优先权本专利申请要求2013年8月8日提交的美国临时专利申请61/863,829的优先权，该临时专利申请全文以引用方式并入本文。
本专利技术描述了通过降低RNA干扰(RNAi)来提高真核细胞中的转基因表达的方法，以及由这种方法制备的变体细胞。这些方法和变体细胞可用于例如在真核细胞中高效制备治疗用多肽和工业用多肽。参考文献本文引用的下列参考文献和另外的参考文献特此以引用方式并入本文。Fire,A.etal.(1998).Nature391:806–11.Fulci,V.andMacino,G.(2007)CurrentOpinioninMicrobiology10:199–203.Janus,D.etal.(2009)Microbiology155:3946–56.Nakayashiki,H.(2005)FEBSLetters579:5950–57.Brody,H.andMaiyuran,S.(2009)IndustrialBiotechnology5:53-60.McGinnis,K.(2009)MethodsinMolecularBiology:TransgenicMaize526:91-99.
技术介绍
RNA干扰(RNAi)是RNA分子抑制基因表达这一现象。mRNA(通常由转基因转录得到)在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)作用下转变成双链RNA(dsRNA)时，发生RNA干扰。dsRNA成为Dicer样蛋白的底物，被Dicer样蛋白切割成长度为约25个核苷酸或更短的小干扰dsRNA(siRNA)。接着siRNA整合到RNA诱导沉默复合物(RISC)中，RISC以序列特异性方式，基于特定siRNA的序列，靶向作用于另外的转基因mRNA，将其降解。结果造成转基因的表达降低，而且与该转基因具有足够相似核苷酸序列的内源基因的表达也降低。Fire和Mello在Caenorhabditiselegans(Fire,A.etal.(1998).Nature391:806–11)中首次描述了这种现象。RNAi普遍存在于多种真核细胞中，并有多种不同的名称，包括共抑制、转录后基因沉默(PTGS)和基因压制。术语“基因压制”通常专指真菌分子生物学领域的RNAi现象。一些真菌可能有强烈的基因压制响应，而其他真菌只有微弱的基因压制响应，甚至根本没有这种响应。20世纪90年代初首次在脉孢菌属(Neurospora)中阐述了基因压制(Romano,N.etal.(1992)Mol.Microbiol.6:3343–53)。
技术实现思路
本专利技术描述了一种通过将降低了RNA干扰(RNAi)量的基因改变引入真核细胞来提高该细胞中的转基因表达水平的方法。下列分别编号的段落概述了本专利技术的方法和变体细胞的诸方面和多个实施方案：1.在一个方面，本专利技术提供了一种提高真核细胞中的转基因表达水平的方法，该方法包括将基因改变引入真核细胞，与不存在该基因改变时的RNA干扰量相比，该基因改变降低细胞中的RNA干扰量。2.在段落1所述方法的一些实施方案中，基因改变减少或阻止细胞中dsRNA和/或siRNA的形成。3.在段落1或2所述方法的一些实施方案中，基因改变包括Dicer样基因的破坏。4.在段落1或2所述方法的一些实施方案中，基因改变包括RNA依赖性RNA聚合酶的破坏。5.在段落3或4所述方法的一些实施方案中，基因的破坏是基因诱变的结果。6.在段落3至5所述方法的一些实施方案中，基因的破坏采用位点特异性重组来进行。7.在段落3至6所述方法的一些实施方案中，基因的破坏与在该基因的基因座处引入选择性标记组合进行。8.在段落3至7所述方法的一些实施方案中，基因的破坏与引入编码目的蛋白的转基因组合进行。9.在段落1至8所述方法的一些实施方案中，与不含该基因改变的同等细胞产生的单位量生物质的蛋白总量相比，细胞产生基本上相同量的每单位量生物质的蛋白总量。10.在段落1至9所述方法的一些实施方案中，其中所述真核细胞为植物细胞、动物细胞、昆虫细胞或真菌细胞。11.在段落1至9所述方法的一些实施方案中，真核细胞为丝状真菌细胞。12.在段落10所述方法的一些实施方案中，真核细胞为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种细胞。13.在段落11所述方法的一些实施方案中，丝状真菌为里氏木霉(Trichodermareesei)。14.在一些实施方案中，段落1至7或9至13所述的方法还包括将用于表达目的蛋白的转基因引入细胞。15.在一些实施方案中，段落8或14所述的方法还包括将所述转基因的附加拷贝引入细胞，其中，将所述转基因的附加拷贝引入细胞之后，所述转基因的表达水平不低于将所述转基因的附加拷贝引入细胞之前的表达水平。就段落8的实施方案而言，本段落中提到的“所述转基因的附加拷贝”是除段落8中提到的转基因之外附加的拷贝。16.在段落14或15所述方法的一些实施方案中，在引入降低或阻止RNA干扰的基因改变之前，细胞中存在编码目的蛋白的转基因。17.在段落14或15所述方法的一些实施方案中，在引入降低或阻止RNA干扰的基因改变之后，向细胞引入编码目的蛋白的转基因。18.在另一方面，本专利技术提供了一种从转化或转染的细胞中筛选出高效表达转基因的细胞的方法，该方法包括：将基因改变引入细胞，与不存在该基因改变时的RNA干扰量相比，该基因改变降低细胞中的RNA干扰量；然后将转基因引入细胞，其中前述基因改变使转化或转染的细胞中的转基因所编码蛋白质的平均表达水平提高；从而与转化或转染的细胞不包含基因改变时所必须筛选的细胞数相比，允许筛选更少的转化或转染的细胞，就可从中识别出高效表达该转基因所编码蛋白质的细胞。段落2至13和15至17中任一段落所述的实施方案可与段落18所述的方法组合使用。19.在另一方面，本专利技术提供了一种提高真核细胞中的转基因表达水平的方法，该方法包括在与RNA干扰相关的基因的基因座处引入转基因，其中引入转基因破坏了与RNA干扰相关的基因，降低了细胞中的RNA干扰量，从而相比于与RNA干扰相关的基因完好无损时细胞中的转基因表达水平，提高了转基因表达水平。段落2至7、9至13和15至17中任一段落所述的实施方案可与段落18的方法组合使用。20.在另一方面，本专利技术提供了一种采用根据权利要求1至19中任一项所述的方法制备的真核细胞。21.在另一方面，本专利技术提供了一种采用根据权利要求1至19中任一项所述的方法制备的目的蛋白。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于提高真核细胞中转基因的表达水平的方法，所述方法包括将基因改变引入所述细胞，与不存在所述基因改变时的RNA干扰量相比，所述基因改变降低所述细胞中的RNA干扰量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.08 US 61/863,8291.一种用于提高真核细胞中转基因的表达水平的方法，所述方法包括将基因改变引入
所述细胞，与不存在所述基因改变时的RNA干扰量相比，所述基因改变降低所述细胞中的
RNA干扰量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因改变减少或阻止所述细胞中dsRNA和/或
siRNA的形成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因改变包括Dicer样基因的破坏。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因改变包括RNA依赖性RNA聚合酶的破
坏。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述基因的所述破坏是所述基因诱变的结果。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述基因的所述破坏使用位点特异性
重组来进行。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述基因的所述破坏与在所述基因的
基因座处引入选择性标记组合进行。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述基因的所述破坏与引入编码目的
蛋白的转基因组合进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中与不含所述基因改变的同等细胞产生
的每单位量生物质的蛋白量相比，所述细胞产生基本上相同量的每单位量生物质的蛋白总
量。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述真核细胞为植物细胞、动物细
胞、昆虫细胞或真菌细胞。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述真核细胞为丝状真菌细胞。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述真核细胞为盘菌亚门(Pezizomycotina)物
种细胞。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述丝状真菌为里氏木霉(Trichoderma
reesei)。
14.根据权利要求1至7以及9至13中任一项所述的方法，所述方法还包括将用于表达目
的蛋白的转基因引入所述细胞。
15.根据权利要求8或14所述的方法，所述方法还包括将所述转基因的附加拷贝引入所
述细胞，其中，将所述转基因的附加拷贝引入所述细胞后，所述转基因的表达水平不低于将
所述转基因的附加拷贝引入所述细胞之前所述转基因的表达水平。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中在引入降低或阻止RNA干扰的所述基因改变
之前，所述细胞中存在编码所述目的蛋白的转基因。
17.根据权利要求14或15所述的方法，其中在引入降低或阻止RNA干扰的所述基因改变
之后，向所述细胞引入编码所述目的蛋白的转基因。
18.一种用于从转化或转染的细胞中筛选出高效表达转基因的细胞的方法，所述方法
包括：将基...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·米亚斯尼科夫，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US