本发明专利技术公开了一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法。该培养基含有活化素A、表皮生长因子、 β-神经生长因子、尼克酰胺、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的UltraCULTURE培养基。该诱导方法为：采用上述诱导培养基对间充质干细胞进行诱导分化培养即可。本发明专利技术诱导培养基含有简单的诱导因子，不含有毒有害物质，更安全。本发明专利技术诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，21天可获得聚团胰岛样细胞，28天可获得部分成熟分化的胰岛样细胞，建立了规范的、新颖的诱导方法，具有广阔的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞领域，具体涉及一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基及其诱导方法。
技术介绍
糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖、糖尿为特征的代谢性综合征。病人持续性的高血糖与长期的代谢紊乱等可导致全身各个系统的损害及其功能障碍。糖尿病的临床治疗包括糖尿病教育、运动治疗、饮食治疗、降糖药物及胰岛素治疗等常规疗法，但目前的治疗效果并不理想，因此需要寻找新的胰岛替代物治疗糖尿病。同种异体胰腺移植的效果差，手术复杂、死亡率高、移植排斥反应强烈，大量开展极为有限。另一方面，干细胞作为再生医学和组织工程领域的研究热点之一，具有自我更新与多向分化潜能，干细胞具有自我更新与多向分化潜能，有研究证明，胚胎干细胞、骨髓干细胞、人脐带血干细胞等可被定向诱导分化为胰岛素分泌细胞，成为胰岛细胞新的来源，因此干细胞诱导分化胰岛样细胞成为研究热点。基于以上两个方面原因，我们需要一个高效、快速和稳定的胰岛细胞分化平台作为以上研究和应用的载体。但胚胎干细胞存在培养扩增难度大，成瘤性强，并存在伦理问题等；骨髓间充质干细胞来源受限，扩增难度大，而且对供者存在一定的损伤。因此诱导后的胰岛样细胞应用受限，无法满足大量需求，比如用于替代治疗糖尿病，以及进行细胞药物的筛选。目前国内外集中于以间充质干细胞为来源诱导胰岛细胞分化为主，人脐带间充质干细胞是从脐带华通胶质中分离出的新型干细胞，其再生能力强，来源丰富，表面抗原性很弱，不被受体的免疫系统所识别，移植物抗宿主病极少见，并且具有向胰岛细胞等方向分化的功能,可作为移植治疗糖尿病的种子细胞。采用策略主要是多种生长因子来联合诱导，从而获得成熟的定向分化细胞。然而怎样才能将其高效诱导分化成胰岛样细胞，用于细胞生物治疗其中仍存在许多问题亟需解决:1)干细胞分化为胰岛样细胞，受干扰因素非常多，首先是诱导方案不确定；2)采用的诱导因子不规范，不能保证干细沿预期方向分化、增殖；3)多采用β-巯基乙醇，其毒性令人望而却步，影响后续临床应用；4)诱导分化后的胰岛样样细胞胰岛素分泌效率低。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术建立了一种规范的、新颖的诱导方法，可高效、稳定地将脐带间充质干细胞诱导为胰岛样细胞。本专利技术的目的在于提供一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基；本专利技术的另一目的在于提供一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，该培养基含有以下组分：活化素A2～6nmol/L表皮生长因子20～30μg/Lβ-神经生长因子80～120μg/L尼克酰胺5～15mmol/L胰岛素-转铁蛋白-硒0.5～1.5%碱性成纤维细胞生长因子5～15μg/LUItraCULTURE培养基余量。进一步的，上述培养基含有以下组分：活化素A4nmol/L表皮生长因子25μg/Lβ-神经生长因子100μg/L尼克酰胺10mmol/L胰岛素-转铁蛋白-硒1%碱性成纤维细胞生长因子10μg/LUItraCULTURE培养基余量。一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：通过组织块方法从脐带中分离获得间充质干细胞后，流式细胞仪鉴定其表面标记。将第三代人脐带间充质干细胞用上述所述的培养基分两阶段诱导培养，第一阶段，在UltraCULTURE培养基中加入4nmol/L活化素A，25μg/L表皮生长因子，100μg/Lβ-神经生长因子，10mmol/L尼克酰胺，培养至14d；第二阶段，在UltraCULTURE的培养基中加入1%胰岛素-转铁蛋白-硒，10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子，培养诱导时间为14d。以UItraCULTURE培养的脐带间充质干细胞作为阴性对照。进一步的，上述诱导培养至少28天后即可获得成熟的胰岛样细胞。本专利技术的有益效果是：1）诱导培养基中所含细胞因子，均属于无毒害物质，更安全；2）本专利技术诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，21天即可发现诱导细胞聚团生长并可释放胰岛素，28天可获得成熟的胰岛样细胞团，与现有技术诱导时间不稳定，诱导细胞不成熟，胰岛素分泌量过低相比，大大增加了诱导效率；3）人脐带组织易于获得；分化后胰岛样细胞的胰岛素表达更高，可为胰岛缺失相关疾病细胞治疗提供理想的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。附图说明图1流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面免疫表型，阴性表达CD14-FITC、CD34-PE、HLA-DR-APC，阳性表达CD44-FITC、CD90-PE、CD105-APC，符合干细胞表面标志表达；图2脐带间充质干细胞在向胰岛样细胞分化的过程中形态变化。(A)第三代脐带间充质干细胞呈现梭型形态(100X)；(B)分化培养的14d后，干细胞形态开始呈现神经纤维样(100X)；(C)分化培养21d后，部分脐带间充质干细胞开始聚集抱团(100X)；(D)分化培养第28d后，脐带间充质干细胞形态变为典型的胰岛样细胞团(100X)；图3干细胞诱导前、诱导14d以及诱导培养28d后的细胞流式检测胰岛素表达情况，在诱导培养的过程中，随着诱导时间延长，胰岛素表达量逐渐增加；图4胰岛β细胞胞浆中高浓度的锌离子是其分泌胰岛素调节血糖所必须的基本条件之一，双硫腙（DTZ）能特异地与锌离子螯合，形成棕色络合物。与对照组相比，诱导组细胞双硫腙染色形成棕色络合物。具体实施方式一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，其特征在于：该培养基含有以下组分：活化素A2～6nmol/L表皮生长因子20～30μg/Lβ-神经生长因子80～120μg/L尼克酰胺5～15mmol/L胰岛素-转铁蛋白-硒0.5～1.5%碱性成纤维细胞生长因子5～15μg/LUItraCULTURE培养基余量。优选的，上述培养基含有以下组分：活化素A4nmol/L表皮生长因子25μg/Lβ-神经生长因子100μg/L尼克酰胺10mmol/L胰岛素-转铁蛋白-硒1%碱性成纤维细胞生长因子10μg/LUItraCULTURE培养基余量。一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：通过组织块方法从脐带中分离获得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，其特征在于：该培养基含有以下组分：活化素A 2～6nmol/L表皮生长因子 20～30μg/Lβ‑神经生长因子 80～120μg/L尼克酰胺 5～15mmol/L胰岛素‑转铁蛋白‑硒 0.5～1.5%碱性成纤维细胞生长因子 5～15μg/LUItraCULTURE 培养基 余量。
【技术特征摘要】
1.一种诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞的培养基，其特征在于：该培养基
含有以下组分：
活化素A2～6nmol/L
表皮生长因子20～30μg/L
β-神经生长因子80～120μg/L
尼克酰胺5～15mmol/L
胰岛素-转铁蛋白-硒0.5～1.5%
碱性成纤维细胞生长因子5～15μg/L
UItraCULTURE培养基余量。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：该培养基含有以下组分：
活化素A4nmol/L
表皮生长因子25μg/L
β-神经生长因子100μg/L
尼克酰胺10mmol/L
胰岛素-转铁蛋白-硒1%
碱性成纤维细胞生长因子10μg/L
UItraCULTURE培养基余量。
3.一种诱导人脐带间...
【专利技术属性】
技术研发人员：王意忠，崔晓兰，时瀚，申义，山霞，
申请(专利权)人：王意忠，
类型：发明
国别省市：北京;11
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