本发明专利技术提供一种快速构建高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变测序文库的方法，针对高苯丙氨酸血症两个相关基因PAH和PTS设计了23对PCR引物，以待测样本DNA为模板，进行多重PCR反应，再将反应产物作为模板，以传统PCR方法生成二代测序文库从而完成高通量的深度测序。对二代测序数据的分析可以精确地搜索并确认该疾病在不同患者/携带者中的家族特异性突变标签，评估待测者的患病风险。测序结果显示各个样本对该遗传疾病预测的基因区间覆盖完全，从而达到精确确认基因突变体的测序深度要求。本发明专利技术方法与现有的全外显子测序技术相比，具有操作简单，操作周期短，试剂耗材消耗少等优点，可用于样本的大批量测序文库的快速制备和同步检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测
和二代高通量测序
，特别是涉及一种高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变的测序文库构建方法。
技术介绍
高苯丙氨酸血症(HPA)是一种常见的先天性、常染色体隐性遗传的氨基酸代谢病。其中以苯丙酮尿症(PKU)较为典型，另外还有四氢生物蝶呤代谢酶缺乏症也会产生类似症状。该疾病是一种先天性氨基酸代谢障碍病，以苯丙氨酸羟化酶活性缺乏，致血浆苯丙氨酸浓度升高为特征，常造成严重智能迟缓。根据我国HPA的新生儿筛查资料统计，全国HPA的发病率约在1/11000水平。新生儿期患儿无任何临床表现，新生儿筛查即是通过血液生化检测在群体中对每个新生儿进行筛检。新生儿筛查尽管能够早期鉴别诊断，早期明确病因、对症治疗，但并不能从根本上杜绝该遗传病的发生。由于高苯丙氨酸血症这种遗传病的发生的主要原因在于苯丙氨酸羟化酶(PAH)或者辅酶(PTS)的功能缺陷。而这两个相关基因上发生的突变则是导致该两种酶之一产生功能缺陷的原因。迄今为止，已经在这两个基因上发现500余种不同的基因突变。现有技术对育龄夫妇、胎儿或者新生儿的PAH或BH4等相关基因测序和突变分析可在一定程度上预知新生儿的发病风险，甚至可以采用产前诊断或胚胎植入前诊断预防缺陷患儿的出生。作为金标准的一代测序需要对每个基因的多个外显子单独进行扩增和测序，试剂消耗大，周期长，操作繁琐，效率极低。作为高通量的二代并行测序目前普遍采用的全基因组或者全外显子组测序的手段虽然可以覆盖PAH和PTS两个基因，但是会产生大量与诊断无关的冗余数据，使得单位有效碱基的测序价格高昂，无疑增加了检测成本。因此，亟待提供一种检测准确、省时、省力、省钱的快速检测高苯丙氨酸血症有关突变的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高度特异、操作简单、成本相对低廉的快速构建检测高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变的高通量测序文库的方法。本专利技术针对高苯丙氨酸血症(HPA)两个相关基因PAH和PTS共20个外显子，基于多重PCR技术，设计出一套引物组合，可实现对全部20个外显子的同步扩增，所述引物组合含有针对高苯丙氨酸血症两个相关基因PAH和PTS的共23对PCR引物，针对PAH基因的引物共16对，分别为SEQIDNO:1-32所示的引物；以及针对PTS基因的引物对共7对，分别为SEQIDNO:33-46所示的引物。本专利技术根据特定原则将上述引物优化配制组合为两管，具体如下：引物组合1:SEQIDNO.1-24，SEQIDNO.27-28，SEQIDNO.31-32；引物组合2:SEQIDNO.11-12,SEQIDNO.21-26，SEQIDNO.29-30，SEQIDNO.33-46。以上引物序列均含有自行设计用于与PAH和PTS基因外显子区域特异性结合的靶向序列，此外还包含测序平台所需的通用序列，本专利技术中采用最常见的Illumina平台通用序列。上述的引物组合经替换或去除测序平台通用序列部分后所保留的靶向序列的近似引物及其衍生物也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了上述引物组合在制备检测高苯丙氨酸血症相关遗传突变试剂盒中的应用。上述靶向疾病相关基因的特征引物组合序列，结合特定高通量测序平台(例如Illumina)特异性扩增以及测序延伸引物序列的寡核苷酸结构设计均属于本专利技术的保护范围，在此基础上，如采用其它高通量测序平台而修改相关通用序列也属于本专利技术的保护范围。含有上述引物组合的试剂盒属于本专利技术的保护范围。含有本专利技术引物组合的上述试剂盒可用于检测高苯丙氨酸血症相关遗传突变。本专利技术还提供一种快速构建检测高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变的高通量测序文库的方法，所述方法包括以下步骤：(1)以待测样本DNA作为模板，使用优化配制的2管引物混合物：引物组合1及引物组合2，针对PAH基因和PTS基因进行多重PCR反应，等量混合两管PCR产物；其中，针对PAH基因的引物共16对，分别为SEQIDNO:1-32所示的引物；针对PTS基因的引物对共7对，分别为SEQIDNO:33-46所示的引物；(2)以步骤(1)得到的PCR混合产物作为模板，并利用带有Illumina高通量测序通用连接序列的引物进行第一轮PCR；其中，所述带有Illumina高通量测序通用连接序列的引物序列如SEQIDNO:47-48所示；(3)以步骤(2)得到的第一轮PCR产物作为模板进行第二轮PCR，在第一轮PCR产物的一端添加barcode序列，构建得到的DNA文库用于二代高通量测序。从而通过一次上机解决多个样本多个区域的遗传病基因分型和突变扫描。前述的方法，步骤(3)中所述barcode序列为Illumina二代测序平台的接头序列。例如，通用接头序列Index2(SEQIDNO:49)。本专利技术中采用的Illumina二代测序平台包括但不限于IlluminaHiseq2500。第二轮PCR使用的引物序列如SEQIDNO:47和49所示。前述的方法，步骤(1)中针对基因PAH、PTS的多重PCR反应体系及反应程序参见Chamberlain,Gibbsetal.1988,Ballabio,Ranieretal.1990。多重PCR反应程序：前述的方法，步骤(2)和(3)中第一轮PCR、第二轮PCR的反应体系及反应程序如下：第一轮PCR反应程序：第二轮PCR反应程序：本专利技术进一步提供一种用于构建高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括针对PAH基因的SEQIDNO:1-32所示的引物、针对PTS基因的SEQIDNO:33-46所示的引物、用于Illumina二代测序平台的通用连接序列(例如，SEQIDNO:47-49所示的引物)、用于Illumina二代测序平台的barcode序列(例如接头序列Index2)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。本专利技术针对高苯丙氨酸血症两个相关基因PAH和PTS设计了23对PCR引物，以待测血样或其它活检物提取的DNA作为模板，进行多重PCR反应，再将反应产物作为模板，并以传统PCR方法生成二代测序文库从而进一步完成高通量的深度测序。对二代测序数据的分析可以精确地搜索并确认该疾病在不同患者/携带者中的家族特异性突变标签，评估待测者的患病风险。测序结果显示各个样本对该遗传疾病预测的基因区间覆盖完全，在单个样本仅约100Mbytefastq测序数据量情况下，所有扩增子能够达到100×以上的基因覆盖率，从而达到精确确认基因突变体的测序深度要求。此外，本专利技术提供的高苯丙氨酸血症相关基因高通量测序文库的构建方法与现有的全外显子测序技术相比，具有操作简单，操作周期短，试剂耗材消耗少等优点，可用于样本的大批量测序文库的快速制备和同步检测。附图说明图1为本专利技术实施例2中多重PCR反应原理图。图2为本专利技术实施例2中第一轮PCR反应原理图。图3为本专利技术实施例2中第二轮PCR反应原理图。图4为本专利技术实施例2中针对高苯丙氨酸血症相关基因PAH的Illimina高通量测序结果的IGV图(IntegrativeGenomicsViewer)。图5为本专利技术实施例2中针对高苯丙氨酸血症相关基因PTS的Illimina高通量测序结果的IGV图。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种引物组合，其特征在于，含有针对高苯丙氨酸血症两个相关基因PAH和PTS的共23对PCR引物，针对PAH基因的引物共16对，分别为SEQ ID NO:1‑32所示的引物；以及针对PTS基因的引物对共7对，分别为SEQ ID NO:33‑46所示的引物。
【技术特征摘要】
1.一种引物组合，其特征在于，含有针对高苯丙氨酸血症两个相关基因PAH和PTS的共23对PCR引物，针对PAH基因的引物共16对，分别为SEQIDNO:1-32所示的引物；以及针对PTS基因的引物对共7对，分别为SEQIDNO:33-46所示的引物。2.权利要求1所述的引物组合经替换或去除测序平台通用序列部分后所保留的靶向序列的近似引物及其衍生物。3.权利要求1所述的引物组合在制备检测高苯丙氨酸血症有关遗传突变的试剂盒中的应用。4.含有权利要求1所述引物组合用于检测高苯丙氨酸血症有关遗传突变的试剂盒。5.高苯丙氨酸血症相关基因外显子突变测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)以待测样本DNA作为模板，针对PAH基因和PTS基因进行多重PCR反应，等量混合两管PCR产物；其中，针对PAH基因的引物共16对，分别为SEQIDNO:1-32所示的引物；针对PTS基因的引物对共7对，分别为SEQIDNO:33-46所示的引物；(2)以步骤(1)得到的PCR混...
【专利技术属性】
技术研发人员：林巍，欧文斌，
申请(专利权)人：林巍，
类型：发明
国别省市：北京;11
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