一种从水通道蛋白4探讨脾胃湿热证的方法技术

一种水通道蛋白4探讨脾胃湿热证的方法，慢性浅表性胃炎患者，其中脾胃湿热证，脾气虚证；分别用免疫组化法、荧光定量PCR法检测粘膜组织中的水通道蛋白4(AQP4)的蛋白表达和信使核糖核酸(mRNA)表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种水通道蛋白4探讨脾胃湿热证的方法，具体地说是一种水通道蛋白4探讨脾胃湿热证的方法。
技术介绍
目前公知的中医认为脾主运化、主升清、主统血，为后天之本。脾在五脏中的重要地位是学术界对其研究一直没有停止的原因。近年来脾实质的研究，证型上集中在脾虚证的研究，功能上集中在“脾主运化、尤其脾主运化水谷”的研究，而关于脾胃实证和“脾主运化水液”的研究较少，现代医学认为，水通道蛋白(aquaporin，AQP)是生物膜上特异性转运水的整合蛋白质，参与调节水平衡；在胃粘膜中主要是AQP4的表达。
技术实现思路
诊断标准：1.研究对象：A.慢性浅表性胃炎患者57例，其中辨证属脾胃湿热证者35例，脾气虚证者22例。另选取正常人10例作为对照，本科志愿学生。脾胃湿热证组中，男19例，女16例，年龄18～４０岁，平均(25.3±5.7)岁；脾气虚证组中，男12例，女10例，年龄１８～４２岁，平均(29.4±7.7)岁；正常组10例，年龄１８～２５岁，平均(21.4±1.7)岁。B.诊断标准中医诊断标准；脾胃湿热证和脾气虚证的诊断标准参照2002年国家药品监督管理局颁布的《中药新药临床研究指导原则》；脾胃湿热证：主症为①脘腹胀闷；②口渴少饮；③食少纳呆；④大便溏而不爽；⑤舌质红，舌苔黄腻。次症为：①肢体困重；②身热不扬或汗出不解；③腹胀满；④恶心欲吐；⑤身目黄色鲜明；⑥脉濡数。具备主症3项(舌象必备)；或具备主症两项(舌象必备)，加次症两项，即可诊断为脾胃湿热证。脾气虚证：主症为①食少纳呆；②体倦乏力；③食后或午后腹胀；④大便异常(溏、烂、先硬后溏、时溏时硬)。次症为①神疲懒言；②口淡不渴；③腹痛绵绵；④恶心呕吐；⑤脘闷或肠鸣；⑥面色萎黄；⑦浮肿；⑧排便无力；⑨舌质淡，舌体胖或有齿印，苔薄白；⑩脉细弱。具备主症两项；或具备主症1项加次症两项，即可诊断为脾气虚证。C.正常人的诊断标准无心、肝、脾、肺、肾等系疾病，常规实验室检查正常，胃粘膜胃镜征象和病理组织学基本正常，舌、脉象正常。D.试验材料与仪器羊抗人AQP4的多克隆抗体购自SantsCruz生物技术有限公司；生物化二抗、链霉素亲和素生物素复合物法(SABC)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德公司；Trizol、TaqDNA多聚酶、MMV逆转录酶、四种脱氧核糖核酸(dNTPs)；参照NCBI的genbank，AQP4引物和荧光探针由中山大学达安基因诊断中心设计合成，序列为：正义链引物5GAATCCCGCCCGATCCT3反义链引物5ATATCCAATGGTTTTCCCAATTTC3，荧光探针5FAMTGGACCTGCAGTTATCATMGB3(探针的5端标以荧光报告基因FAM，3’端标以荧光淬灭基因MGB)，AQP4扩增片段长度为62bp；GeneAmpPCRSystem9700(普通PCR仪)和ABIPRISM7000SequenceDetectionSystem(全自动荧光定量PCR仪)，均为美国AppliedBiosystems公司产品；GIF-240XQ型电子胃镜为日本Olympus公司产品。2.方法:病理取材所有受试对象均行电子胃镜检查，胃体距EG线2cm处的大、小弯处分别钳取胃粘膜组织4块，每块05cm×05cm大小，2块组织放入40g/L多聚甲醛中，2块组织放入液氮罐中。根据获得的组织数目，慢性浅表性胃炎患者分别用两种方法检测，免疫组织化学法组织包埋切片后，Ｈ２Ｏ２封闭，微波法热修复抗原，血清封闭液封闭，分别滴加羊抗人AQP4的多克隆抗体、生物化二抗和SABC，DAB显色，苏木素衬染，透明封片。显微镜下观察，细胞膜上有黄色或棕褐色颗粒为阳染细胞，参考邢氏等的标准，以阳染强度×阳染面积比例作为阳性表达指数(蛋白表达量)。阳染强度标准：无阳染细胞计0分，细胞阳染呈浅黄色计1分，阳染呈棕黄色计2分，阳染呈棕褐色计3分。阳染面积比例计算方法：高倍镜下5个视野，计数至少500个细胞中的阳性细胞数，以百分数表示阳染面积比例。总RNA的提取胃粘膜组织加入Trizol，进行匀浆、分层、浓缩、沉淀、洗涤和溶解。每份样品在紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸光度值，计算总RNA的提取率和纯度。逆转录反应，取1μg总RNA，加入MMV逆转录酶10U、25μmol/L下游引物05μL、dNTPs1μL、buffer缓冲液2μL、焦碳酸二乙酯(DEPC)水35μL，PCR仪中37℃反应1h，然后95℃3min。取逆转录反应产物cDNA5μL，加入上下游引物、TaqDNA多聚酶、dNTPs等，PCR仪中93℃反应2min，然后９３℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环，最后是７２℃延伸7min。琼脂糖凝胶电泳，割下目的条带，回收试剂盒(QIAquickGelExtractionKit)回收纯化。紫外分光光度计上测定，根据D260nm测定值和片段长度数据换算出浓度(拷贝数/μL)，做梯度稀释，制备成阳性定量标准品梯度。荧光定量阴性对照品采用双蒸水。FQ-PCR测定不同浓度阳性定量标准品及待测样本的cDNA5μL，加入上下游引物、荧光探针、TaqDNA多聚酶、dNTPs等，荧光定量PCR仪中９３℃2min，然后９３℃1min，55℃1min，７２℃延伸1min，共35～４０个循环。反应结束后，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果。3.结果AQP4蛋白表达的比较；显微镜下观察，AQP4主要表达在粘膜固有层中，分布在胃腺主细胞膜和壁细胞膜的基侧面。脾胃湿热证组阳性染色(阳染)呈深棕黄色，阳染面积比例大；脾气虚证组阳染呈浅棕色，阳染面积小，或无阳染；正常组阳染强度中等，阳染面积也较大。组间阳染结果量化比较：脾胃湿热证组AQP4蛋白表达量高于脾气虚证组(Ｐ＜００1)和正常组(Ｐ＜００５)；脾气虚证组蛋白表达量低于正常组，但两组比较无显著性差异(Ｐ＞００５)。专利技术目的：水平衡是维持生命的关键因素之一。既往认为，水以简单扩散的方式通过生物膜。近年研究发现，在多种器官组织的细胞膜上存在着一种整合蛋白质，即水通道蛋白，它能特异性地介导水转运，是水通过生物膜的主要方式。1988年首次从哺乳动物红细胞膜上分离出AQP1，目前已成功分离10个亚型。AQP功能与其选择性分布有关，对维持细胞、组织、器官及全身的水平衡起着决定性作用；如果不同细胞膜上的AQP表达超过或低于正常水平，都会影响水的分泌或吸收，出现局部或全身水平衡紊乱。转目前在消化道已发现有7种AQP亚型。正常情况下，人体每天通过唾液腺、胃、肝胆、胰腺、小肠、结肠等器官的上皮吸收或者分泌的液体量超过9L，而这些液体在细胞内外的进出可能都与AQP有关。人体的胃组织主要是AQP4表达，且只表达在胃底腺主细胞和壁细胞的膜上，功能是参与胃液的分泌，和/或参与维持壁细胞正常容积。AQP4的作用强度可能与以下因素有关：蛋白表达量、细胞膜上的排列方式、单位膜面积的分布强度等。有实验表明，AQP4剔除基因鼠的壁细胞对水的渗透性下降，胃酸分泌量和对组胺的刺激均较野生型低。技术方案：方法慢性浅表性胃炎患者，其中脾胃湿热证35例，脾气虚证22例；另设10例正常人为对照。胃镜下取胃体上部粘膜，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水通道蛋白4探讨脾胃湿热证的方法，慢性浅表性胃炎患者，其中脾胃湿热证，脾气虚证；分别用免疫组化法、荧光定量PCR法检测粘膜组织中的水通道蛋白4(AQP4)的蛋白表达和信使核糖核酸(mRNA)表达。

【技术特征摘要】
1.一种水通道蛋白4探讨脾胃湿热证的方法，慢性浅表性胃炎患者，其中脾胃湿热证，脾气虚证；分别用免疫组化...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀娟，
申请(专利权)人：杨秀娟，
类型：发明
国别省市：甘肃;62