一种检测生物体系内次氯酸的荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测生物体系内次氯酸的荧光探针，该荧光探针为含有不同取代基团的苯并吡喃衍生物，其化学结构通式如式(I)所示。本发明专利技术的荧光探针易于制备成本低廉，且具有高特异性，可与次氯酸发生化学反应生成对应的氧化产物，在进行相应次氯酸含量检测过程不会受其他组分的干扰，可用于活细胞中次氯酸含量的定量和定性测定，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测生物体系内次氯酸的荧光探针及其应用，属于荧光分析

技术介绍
次氯酸(HClO)是一种很重要的活性氧物质，在生物体系内参与众多的生理、病理过程。生物体系内的次氯酸主要来源于髓过氧化物酶催化条件下，体内过氧化氢和氯离子的反应。次氯酸可以将体内多种生物大分子如蛋白、脂质、DNA和RNA等氧化修饰。作为强亲核非自由基氧化试剂，次氯酸可以通过促进细胞内溶酶体、吞嗟体的融合，达到阻止微生物的入侵的目的，在抵抗外源性物质和中和毒素方面也起着重要作用。次氯酸与蛋白、氨基酸反应生成的氯胺可作用于蛋白酶抑制因子，刺激中性粒细胞释放胰蛋白酶、弹性蛋白酶等各种蛋白酶，以降解外来蛋白、清除受损细胞以及病原体残骸。人体内次氯酸浓度的异常，通常会导致关节炎、动脉硬化症以及癌症等疾病的产生。次氯酸直接或者间接的参与了滑膜与骨质的损伤，可使胶原裂解、与关节液的维生素C反应从而影响骨软骨功能，引起类风湿关节炎。非选择性的次氯酸在抵抗外界微生物入侵的同时，也会对体内生物大分子产生氧化损伤作用。次氯酸可以通过妨碍血管内皮细胞修复及其功能，促使血管产生病变。因此检测生物体系内的次氯酸对于关节炎、动脉硬化症以及癌症等疾病的产生发展机制研究，以及预防诊治都有着极为重要的作用。荧光成像技术适用于活生物体系内生物分子的定位监测和实时跟踪，并因高灵敏度、快速响应和原位检测等优点而成为分析各种生物分子的重要检测手段。传统的次氯酸检测主要采用滴定法，但是这种技术无论是在准确性还是在适用性上，均无法与荧光成像技术媲美。近年来，分子荧光探针的研究促进了荧光成像技术的快速发展，有助于研究生物分子在生命体系中的生理机制和疾病的病理。此外在生命体系中，荧光探针能够对被分析物进行高时空分辨的快速检测，对生物样品基本无破坏。因此，应生物体系中次氯酸浓度水平检测的要求，设计及合成选择性好、灵敏度高、具有低细胞毒性的用于检测活细胞核组织内次氯酸浓度变化的次氯酸分子荧光探针，对于研究活生物体系内信号转导、生理病理和重大疾病的早期诊断具有十分重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种检测生物体系内次氯酸的荧光探针及其应用。本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针为含有不同取代基团的苯并吡喃衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式(I)所示：其中：R1＝R2＝H，命名为1a；或R1＝H，R2＝C2H5，命名为2a；或R1＝CH3，R2＝H，命名为3a；或R1＝CH3，R2＝C2H5，命名为4a。本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针优选的实施方式是：所述荧光探针的化学结构通式如式(I)所示，其中：R1＝R2＝H。本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针的制备方法为：将3-乙酰基-7-羟基香豆素(1mmol)、4-(二乙基氨基)水杨醛(1mmol)和甲磺酸(5mL)加入到50mL单口烧瓶中，回流6小时，冷却，倒入10g冰中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化，得到深蓝色产物即为本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针。本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针在检测含次氯酸的生物样品中的应用。其中：所述含次氯酸的生物样品是生物组织或细胞，优选是生物活细胞。本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针可应用于生物体系中次氯酸的定性和定量评价。该探针作为次氯酸的特异性探针，可与次氯酸发生化学反应，生成对应的氧化产物，通过定量检测氧化产物的荧光强度来测定生物体系中次氯酸的含量。具体测定方法为：室温条件下，配制5μM荧光探针PBS溶液(含5％甲醇，pH＝7.4)，将次氯酸的PBS溶液加入到该探针体系中，测定溶液荧光强度作为次氯酸含量的评价指标。见图5。本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针本身具有微弱的荧光，与次氯酸反应的氧化产物具有很强的蓝色荧光，可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为410nm，在420～700nm之间进行荧光发射光谱的检测。见图3-4。荧光探针在生物成像应用研究主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细胞和活组织荧光成像。采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论荧光探针对细胞的毒性。借助流式细胞仪，检测细胞在加入荧光探针培育之后的染色比例，进而考察荧光探针对细胞的染色能力。在此基础上，应用本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针对活细胞或活组织进行检测，能够对该样品中的次氯酸实现荧光成像，达到对细胞中的次氯酸快速准确检测的目的。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针具有高特异性，可与次氯酸发生化学反应生成对应的氧化产物，在进行相应次氯酸含量检测过程不会受其他组分的干扰，可用于活细胞中次氯酸含量的定量和定性测定，具有广阔的应用前景。本专利技术所述的检测生物体系内次氯酸的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性(400～500nm)，通过绘制标准曲线进行次氯酸定量测定，可以实现对细胞中的次氯酸快速准确检测的目的。附图说明图1是本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a的1HNMR图谱。图2是本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a在不同pH条件下的荧光光谱。图3是本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a与不同物质作用后的荧光光谱。图4是本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a和次氯酸反应之后的紫外-可见吸收变化结果。图5是本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a和次氯酸反应之后的荧光变化结果。图6是本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a在活细胞中的成像应用。其中：A1、A2和A3依次为探针(10μM)在细胞中明场、蓝色通道和红色通道的成像，A4为A1、A2和A3的叠加图，B1、B2和B3依次为探针(10μM)和次氯酸(100μM)在细胞中明场、蓝色通道和红色通道的成像，B4为B1、B2和B3的叠加图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术保护内容不仅限于此。实施例1：本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a的制备将3-乙酰基-7-羟基香豆素(204mg，10mmol)、4-(二乙基氨基)水杨醛(193mg,10mmol)和甲磺酸(5mL)加入到50mL单口烧瓶中，回流6小时，冷却，倒入10g冰中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化，得到371mg深蓝色产物，即为本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a，产率67％。上述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a的1HNMR图谱见图1。实施例2：本专利技术所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针1a对不同物质的选择性预先准备8份5mL的5μM探针PBS溶液(含5％甲醇，pH＝7.4)，然后分别向该体系中依次加入50μL浓度为10mM的NaClO、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、CH3COOOH、HClO4、cys、GSH、NaNO2、VC等的PBS溶液。然后进行荧光检测(λEx＝410nm,λEm＝452nm)；计算各体系中荧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测生物体系内次氯酸的荧光探针，该荧光探针为含有不同取代基团的苯并吡喃衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式(I)所示：其中：R1＝R2＝H，命名为1a；或R1＝H，R2＝C2H5，命名为2a；或R1＝CH3，R2＝H，命名为3a；或R1＝CH3，R2＝C2H5，命名为4a。

【技术特征摘要】
1.一种检测生物体系内次氯酸的荧光探针，该荧光探针为含有不同取代基团的苯并吡喃衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式(I)所示：其中：R1＝R2＝H，命名为1a；或R1＝H，R2＝C2H5，命名为2a；或R1＝CH3，R2＝H，命名为3a；或R1＝CH3，R2＝C2H5，命名为4a。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，董宝利，宋学真，王超，唐永和，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37