一种检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，包括利用序列分析软件对STAT3和LCK设计引物；然后进行肿瘤组织RNA提取和 cDNA 获得，采用qPCR以及IHC的方法特异性的检测STAT3和LCK在组织样品的表达情况；根据qPCR和IHC的结果，判定组织样品中特异性抗原STAT3和LCK的表达情况。本发明专利技术的有益效果：通过检测STAT3与LCK在肺癌脑转移样品中的抗原表达情况，来作为肺癌脑转移诊断的检测靶点，并且可以提前预测肺癌脑转移的风险。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体来说，涉及一种检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法。
技术介绍
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康，是我国乃至全世界公关的重点疾病之一，其发病率有逐渐增加的趋势。近年来的肿瘤学研究和临床观察，发现环境因素与个人行为对人类肿瘤的发生和发展有着重要的影响。越来越多的研究表明几乎所有的恶性肿瘤都与外界所遭受的环境因素有关。各种环境因素以不同的方式造成了有机体遗传物质的损伤，例如基因的突变、重组等，从而直接或间接的造成原癌基因的激活或者抑癌基因的失活，使细胞病变、永生化，继而造就了肿瘤的产生。归根结底，肿瘤是一类基因疾病。近年来发展起来的免疫治疗和细胞治疗针对的是就是导致肿瘤产生的特异性的基因，来靶向杀死肿瘤细胞。神经胶质瘤是中枢神经系统中最为常见的恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的40%‐50%。近年来，虽然神经外科的技术水平、放疗设备和化疗药物等方面都有了长足发展。但由于神经胶质瘤具有侵袭性生长，和正常的脑组织相粘连，分界不清，对放疗及常规化疗高度抵抗等特点，治疗效果并不理想。有数据显示，仅有不到30%的胶质瘤患者的生存期能超过2年。因此在分子水平上对胶质瘤的发病机制进行研究，探索新的治疗手段和技术，为神经胶质瘤的临床诊断及治疗提供新的路径。信号转导是生命科学前沿领域研究的热点，细胞信号转导过程发生障碍或异常必然导致细胞生长、分化、代谢和生物学行为的异常，引起各种疾病乃至肿瘤的发生。细胞因子介导的JAK激酶(JanusKinase，JAK)-信号转导和转录活化因子(signaltransducerandactivatorsoftransduction，STAT)途径是非受体型酪氨酸激酶介导信号转导通路的经典途径。STAT3是STAT家族的重要成员，是一种原癌基因，也被称为急性相反应因子，广泛存在于不同类型的正常细胞和组织中，其具有以下特征：①一个末端结构域，参与蛋白与蛋白之间的相互作用，②一个卷曲的盘状结构域介导与其他蛋白的作用，③特异的DNA结合结构域，④一个连接结构域，⑤SH2结构域，主要促使STAT3与活化的受体形成复合物，介导JAK-STAT间的相互作用，使STAT3形成二聚体，移至细胞核，识别并结合DNA，导致特定靶基因的开启，在信号转导中起重要作用，⑥C-末端的转录活化结构域，所有的STATs蛋白在SH2—结构域与转录活化结构域之间都含有一个保守的酪氨酸。很多细胞因子或者G蛋白受体途径以及JAK激酶、生长因子的内源性酪氨酸激酶途径，都介导着STAT的活化。当细胞因子或生长因子与细胞表面的受体结合后，STAT单体发生酪氨酸磷酸化，一旦磷酸化，STATs二聚体（同源或异源）与磷酸化的-SH2机构域相互作用，几分钟内二聚体便可转位至细胞核内，与其他转录调节子相互作用结合到特异的启动子序列并诱导基因的表达。转录因子STAT蛋白家族介导着几乎所有的细胞因子信号，从而调节着免疫系统、红细胞生成、神经与胚胎的形成及细胞的生长、分化等。STAT信号传导通过核酪氨酸磷酸酶和/或蛋白溶解降解作用的去磷酸化后而终止。在正常生理状态下，STAT3的激活是快速而短暂的，且受严密调控之中的。如果STAT3无法受到严密调控，被持续性激活，将诱导细胞增殖、分化、凋亡密切相关的关键基因的异常高表达，通过各种途径促进细胞失控性增殖、恶性转化、加速血管生成介导免疫逃逸并参与传统化疗所诱导的凋亡抗性，表现出致癌作用。且在人类许多肿瘤细胞系及实体肿瘤组织中发现癌组织中存在STAT3持续性激活，国内外就STAT3及其磷酸化与肿瘤发生、发展等方面有较为广泛研究，并有大量的相关性研究进展的报导及论文发表。Src蛋白酪氨酸激酶（Srcproto-oncogenictyrosinekinases）家族在肿瘤发生与发展中起关键作用，是重要的肿瘤治疗靶向分子。淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lymphocytespecificproteintyrosinekinase，LCK）是Src家族成员的蛋白酪氨酸激酶，主要存在于淋巴细胞内，参与T细胞的发育、分化、活化的信号转导过程。LCK（NM_005356）由509个氨基酸残基组成，分子量为56K。LCK分子包括3个结构区。（1）激酶区：该区包括一个ATP结合位点（Lys273），一个自身磷酸化位点（Tyr294）和一个活性调控位点（Tyr505）。Lys的突变可使激酶活性丧失。Tyr394的磷酸化使激酶活性增强。调控位点Tyr505的磷酸化对调节激酶活性起着重要作用。细胞处于静止状态时，Tyr505高度磷酸化，LCK激酶活性减弱。Tyr505的去磷酸化使激酶活性增强。（2）SH2和SH3区（Srchomologyregion2and3）：是位于激酶区N端的两个高度保守的相邻片段，约含100个氨基酸残基。该区的突变活缺失会影响激酶活性并引起细胞形态的改变。SH2和SH3还是LCK分子信号传导的关键部位。（3）可变区：与以上各区的保守性相反，Src家族成员氨基末端70－80个氨基酸残基变化较大，是它结合于不同膜分子的结构基础。LCK氨基末端的甘氨酸（glycine）与豆蔻酸集团结合，通过这个豆蔻酸集团LCK分子结合在细胞膜内表面。该区还包括可被蛋白激酶C磷酸化的丝氨酸位点。国内外许多研究显示：LCK的异常表达和调节与细胞的癌变密切相关，如在转基因小鼠，LCK的表达导致胸腺肿瘤，在人淋巴细胞和非淋巴细胞恶性肿瘤均有LCK异常表达或激活。但关于STAT3和LCK是否能作为肺癌脑转移的检测靶抗原还未见报道。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，用以解决现有技术中存在的问题。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，包括以下步骤：S1、设计引物：利用序列分析软件设计引物；S2、检测模板的获得：进一步包括：S2.1、组织样品RNA的提取：取适量RNAlater保存的组织样品，参照TRIzol裂解法提取组织样品RNA；S2.2、获得模板cDNA：以组织样品RNA为模板，oligodT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；S3、STAT3和LCK的检测：采用qPCR、WB以及IHC的方法特异性的检测STAT3和LCK在组织样品的表达情况；S4、结果分析：根据qPCR和IHC的结果，判定组织样品中特异性抗原STAT3和LCK的表达情况。进一步，在步骤S1中，STAT3正向引物的碱基序列为SEQIDNO：1，STAT3反向引物的碱基序列为SEQIDNO：2。进一步，在步骤S1中，LCK正向引物的碱基序列为SEQIDNO：3，LCK反向引物的碱基序列为SEQIDNO：4。进一步的，在步骤S2.1中，组织样品RNA的提取包括以下步骤：S2.1.1、组织样品的选取和制备：手术切下的肿瘤组织及用作阴性对照的良性肿瘤组织，切除边缘，选取中间完好的组织块在最短的时间内放置于RNAlater中在-80℃下保存，防止RNA降解；S2.1.2、取30mgRNAlater保存样品，加1mlTRIzol充分研磨，使组织块充分裂解，按200μl/mlTRIzol的比例加入氯仿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、STAT3和LCK引物设计：利用序列分析软件设计引物；S2、检测模板的获得：进一步包括：S2.1、组织样品RNA的提取：取适量RNAlater保存的组织样品，参照TRIzol裂解法提取组织样品RNA；以及S2.2、获得模板cDNA：以组织样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；S3、STAT3和LCK的检测：采用qPCR、WB以及IHC的方法特异性的检测STAT3和LCK在组织样品的表达情况；S4、结果分析：根据qPCR和IHC的结果，判定组织样品中特异性抗原STAT3和LCK的表达情况。

【技术特征摘要】
1.一种检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、STAT3和LCK引物设计：利用序列分析软件设计引物；S2、检测模板的获得：进一步包括：S2.1、组织样品RNA的提取：取适量RNAlater保存的组织样品，参照TRIzol裂解法提取组织样品RNA；以及S2.2、获得模板cDNA：以组织样品RNA为模板，oligodT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；S3、STAT3和LCK的检测：采用qPCR、WB以及IHC的方法特异性的检测STAT3和LCK在组织样品的表达情况；S4、结果分析：根据qPCR和IHC的结果，判定组织样品中特异性抗原STAT3和LCK的表达情况。2.根据权利要求1所述的检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，其特征在于：在步骤S1中，STAT3正向引物的碱基序列为SEQIDNO：1，STAT3反向引物的碱基序列为SEQIDNO：2。3.根据权利要求2所述的检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，其特征在于：在步骤S1中，LCK正向引物的碱基序列为SEQIDNO：3，LCK反向引物的碱基序列为SEQIDNO：4。4.根据权利要求1所述的检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，其特征在于：在步骤S2.1中，组织样品RNA的提取包括以下步骤：S2.1.1、组织样品的选取和制备：将肿瘤组织及用作阴性对照的良性肿瘤组织，切除边缘，选取中间完好的组织块在最短的时间内放置于RNAlater中在-80℃下保存，防止RNA降解；S2.1.2、取30mgRNAlater保存样品，加1mlTRIzol充分研磨，使组织块充分裂解，按200μl/mlTRIzol的比例加入氯仿，充分震荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟；S2.1.3、取上层水相于另一新的EP管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA，4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀的RNA；S2.1.4、用75%乙醇洗涤沉淀得到的RNA，4℃，12000rpm离心10分钟；S2.1.5、弃掉乙醇，待乙醇挥发殆尽，适量DEPC水溶解组织样品RNA。5.根据权利要求1所述的检测肺癌脑转移样本中STAT3和LCK的方法，其特征在于：在步骤S2.2中，获得模板cDNA包括以下步骤：S2.2.1、利用超微量分光光度计测组织样品的RNA浓度；S2.2.2、在冰上准备0.2ml无酶PCR反应管并建立逆转录反应体系20μl，其中，RNA为1μg；10X逆转录缓冲液为2.0μl；25mM脱氧核糖核苷三磷酸混合液为0.8μl；10mM多聚胸腺嘧啶核苷酸链为2.0μl；逆转录酶为1.0μl；RNA水解酶抑制剂为1.0μl；余量为无核酸酶水；以及S2.2.3、轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，再依次置于如下条件下反应，获得模板cDNA：25℃反应1...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖云鹏，李军旗，袁晓辉，何有文，廖化新，
申请(专利权)人：广州泰诺迪生物科技有限公司，珠海泰诺麦博生物技术有限公司，暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44