一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用，L2在MRS培养液中的培养条件为：接种量3.1％、初始pH 6.4、培养温度18.4℃。本发明专利技术从青海本地泡菜及青贮中分离耐低温乳酸菌，并从中筛选出一株生长繁殖能和发酵产酸能力较为优良的耐低温乳酸菌。通过培养优化实验，确定其最适培养温度、初始pH条件和最适接种量，找到该菌最佳扩培条件，为其应用过程中的扩大培养提供理论依据。将其添加到六种不同原料的青贮中，通过感官评定、pH评定、营养成分测定以及发酵产气试验评价该菌青贮调制的实际作用，对解决牧区饲草料短缺，减轻草原放牧压力，保护生态环境具有现实意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业
，具体地说，涉及一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用。
技术介绍
青贮饲料具有贮藏时间长、消化利用率高、原料来源广、贮存空间小、调制方便且受环境因素影响小等优点，可以很好为牲畜补饲提供优质饲料，保证饲料全年的充足供应。冬季是牲畜饲草料缺口最大的季节，这个时候补饲的青贮饲料大多是在秋冬季节所调制。地处高原的青海省年平均温度较低，秋冬季节收获的青贮原料在青贮调制过程中，原料自身携带的不多的乳酸菌代谢繁殖会受到低温的抑制，难以调制出高品质的青贮饲料。对此，外界添加优良的青贮乳酸菌添加剂，对提高青贮品质显得尤为重要。市售青贮乳酸菌添加剂中乳酸菌最适温度一般在30℃左右，10℃以下几乎不生长。因此在青贮发酵前期青贮窖中积累热不足，环境温度又很低的情况下很难发挥有效作用。若在青贮中添加耐低温乳酸菌，不仅可以增加青贮乳酸菌数量，还可以在青贮饲料内部积累热不足的较低温度下发生代谢产酸的反应，提前实现较低的pH环境，从而更好的抑制腐败菌的活动，提高青贮品质。目前国内外有关耐低温乳酸菌的研究相对较少，且多集中于泡菜等食品方面，而青贮用耐低温乳酸菌的报道尚属空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种耐低温乳酸菌的培养方法及其应用，从青海本地泡菜及青贮中分离耐低温乳酸菌，并从中筛选出一株生长繁殖能和发酵产酸能力较为优良的耐低温乳酸菌。通过培养优化实验，确定其最适培养温度、初始pH条件和最适接种量，找到该菌最佳扩培条件，为其应用过程中的扩大培养提供理论依据。其具体技术方案为：一种耐低温乳酸菌的培养方法，L2在MRS培养液中的培养条件为：接种量3.1%、初始pH6.4、培养温度18.4℃。本专利技术所述耐低温乳酸菌的培养方法在青贮饲料制备过程中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术从青海本地泡菜及青贮中分离耐低温乳酸菌，并从中筛选出一株生长繁殖能和发酵产酸能力较为优良的耐低温乳酸菌。通过培养优化实验，确定其最适培养温度、初始pH条件和最适接种量，找到该菌最佳扩培条件，为其应用过程中的扩大培养提供理论依据。将其添加到六种不同原料的青贮中，通过感官评定、pH评定、营养成分测定以及发酵产气试验评价该菌青贮调制的实际作用，为该菌在青海省青贮饲料添加剂的开发与应用方面提供理论基础，对解决牧区饲草料短缺，减轻草原放牧压力，保护生态环境具有现实意义。附图说明图1是各菌株生长曲线，其中，R1为1号球菌；R2为2号球菌；L1为1号杆菌；L2为2号杆菌；L3为3号杆菌；图2培养液pH变化曲线，其中，R1为1号球菌；R2为2号球菌；L1为1号杆菌；L2为2号杆菌；L3为3号杆菌；图3是接种量和初始pH对乳酸菌生长影响的响应面图；图4是接种量和温度对乳酸菌生长影响的响应面图；图5是初始pH和温度对乳酸菌生长影响的响应面图；图6是不同处理组粗蛋白含量；图7是不同处理组粗脂肪含量；图8是不同处理组粗纤维含量；图9是不同处理组中性洗涤纤维含量；图10是不同处理组酸性洗涤纤维含量；图11是不同处理组总磷含量；图12是不同处理组总钙含量；图13是不同处理组粗灰分含量；图14是全株油菜、鹅观草各处理组累积产气量；图15是麦鬓草、梭罗草各处理组累积产气量；图16是全株玉米、全株小麦各处理组累积产气量。具体实施方式下面结合附图和具体实施方案对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。1试验材料1.1试验材料泡菜：2012年11月份取自青海大学蔬菜商店泡菜坛；青贮玉米：全株玉米5℃条件下密封袋青贮60天；乳酸菌：从上述新鲜泡菜和青贮玉米中分离得到。1.2培养基MRS培养基：牛肉膏10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、吐温-801ml、柠檬酸二胺2g、乙酸钠5g、K2HPO42g、MgSO4·7H2O2g、MnSO4·4H2O0.25g、葡萄糖20g、琼脂10g、蒸馏水1L，调pH6.2-6.4，121℃灭菌15min。PY培养基：蛋白胨0.5g、胰酶解酪阮0.5g、酵母提取物1.0g、0.1%刃天青液0.1ml、半胱氨酸-HCl·H2O0.05g、盐溶液4.0ml（盐溶液成分:无水CaCl20.2g，MgSO4·7H2O0.48g，K2HPO41.0g,KH2PO41.0g，NaHCO310.0g，NaCl22.0g）、蒸馏水100ml。厌氧条件下将CaCl2和MgSO4·7H2O混合溶解于300ml蒸馏水中，再加500ml水，一边搅拌一边缓慢加人其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加200ml蒸馏水，混合后贮备于4℃。PYG培养基：在PY培养基中加入1.0g葡萄糖，配置方法相同。1.3仪器与设备2试验方法2.1乳酸菌分离与初筛取新鲜泡菜汁液体样品1ml于盛有9ml无菌水的试管中，振荡混匀；全株玉米青贮固体样品称取1g，剪碎置于无菌烧杯中，加50ml无菌生理盐水，摇晃并浸泡数分钟。无菌试管中利用10倍稀释法分别上述两样品溶液稀释至10-3、10-4以及10-5倍，并进行编号。对应编号，吸管移取2滴于的含有0.5%CaCO3的MRS培养基上涂平板。10℃恒温培养72h后，选取周围出现溶钙圈的菌落，利用划线法在空白MRS平板上分离出单菌落，观察菌落形态。分离出的单菌落菌株进行革兰氏染色和接触酶试验，选择溶钙圈较大、革兰氏染色阳性且接触酶试验阴性的菌株，转移至MRS斜面培养基上，2℃恒温保存备用。革兰氏染色：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体在载玻片上均匀涂抹。待涂片干燥，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染色1min。用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干，观察细胞形态。滴加1滴碘液，染1min，水洗。吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。滴加蕃红复染3-5min，水洗。染色结束后镜检，菌体呈红色为革兰氏阴性菌，菌体呈蓝紫色为革兰氏阳性菌。接触酶试验：将试验菌接种于PYG琼脂斜面上，适温培养18-24h。乳酸菌连同培养基在空气中暴露30min后，取一环乳酸菌涂于干净的载玻片上，然后在其上加一滴3%-15%的H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。2.2乳酸菌复筛用接种环分别挑取上述菌种约两环于MRS液体培养基中，10℃培养48h得到母液。将母液分别接入空白MRS液体培养基中，保持接入后菌种浓度一致（4.78lgCFU·mL-1）。10℃恒温培养，每隔12h测定一次菌体浓度及发酵液pH。选出生长速度和产酸能力最好的一株菌种。2.3乳酸菌的鉴定光学显微镜下对菌种进行形态学鉴定；参照伯杰氏细菌鉴定手册和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行乳酸菌生理生化特性鉴定。⑴、精氨酸产氨实验含精氨酸的PY培养液：在PY培养液中加入配制好的精氨酸液（L-精氨酸1.5g、浓度为1g/l0mlH2O的半胱氨酸0.05ml、蒸馏水10ml。调pH至7.0，灭菌后加3滴至3ml培养基中）。奈氏试剂：20gKI溶于50ml蒸馏水中，溶解后再向其中加入约32g的HgI2颗粒，另外加入460ml蒸馏水水和134gKOH混合均匀，上清液贮存于棕色瓶中避光保存备用。乳酸菌接种到含精氨酸的PY培养基中（以不含精氨酸的PY培养基为对照），适合温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐低温乳酸菌的培养方法，其特征在于，L2在MRS培养液中的培养条件为：接种量3.1％、初始pH 6.4、培养温度18.4℃。

【技术特征摘要】
1.一种耐低温乳酸菌的培养方法，其特征在于，L2在MRS培养液中的培养条件为：接种量3.1％、初始...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长慧，李淑娟，许新新，储徐健，
申请(专利权)人：青海大学，
类型：发明
国别省市：青海;63