一种与移植排斥相关的内皮细胞抗原及其应用、试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种与移植排斥相关的人体内皮细胞移植抗原及其应用和临床检测试剂盒。该内皮细胞抗原为角蛋白1。检测角蛋白1抗体的试剂盒用于评估临床移植排斥的风险和状态。本发明专利技术为探究临床器官移植排斥发生的原因与如何预测排斥反应的发生提供新的研究目标，为建立新的临床器官移植风险评估系统提供新思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于器官移植免疫排斥评估预测
，具体涉及一种与移植排斥相关的人体内皮细胞新移植抗原及其应用。
技术介绍
器官移植排斥反应仍然是移植成功的重要屏障。肾移植是迄今挽救终末期肾脏功能衰竭患者生命最理想的治疗手段。而器官移植后出现的超急性、急性和慢性排斥反应使移植物不能在受者体内发挥正常的生理功能，器官被排斥，功能丢失，严重影响移植受者的生活质量和生命安全。移植物主要组织相容性抗原包括ABO血型抗原和人类白细胞抗原(HLA)。然而，在不存在供体HLA抗体的情况下，急性排斥反应也可以发生。预示尚有Non-HLA抗原参与移植排斥反应。目前临床上公认的移植抗原包括ABO血型抗原，HLA与主要组织相容性复合体I类相关链A(MICA)。Non-HLA，如MICA/B，波形蛋白，血管紧张素II1型受体，微管蛋白，肌球蛋白，和胶原蛋白均可成为相应抗体攻击的靶抗原，使移植物遭受免疫损伤。临床上观察到有病例出现在红细胞血型相合和交叉配型阴性的情况下，接受肾移植后仍然发生移植排斥反应的现象。这提示还有其他的因素在移植排斥反应中起作用。移植物的血管内皮是接触受者血液循环的前沿阵地，也是遭受宿主免疫攻击的首要部位。有研究提出，抗内皮细胞抗体在临床器官移植方面具有重要作用。临床上HLA交叉配型反应阴性的肾移植病例出现不明原因的排斥反应很可能与该内皮细胞抗原有关。尽管越来越多的证据表明抗内皮细胞抗体参与了宿主对同种异体移植物的响应，但抗内皮细胞抗体确切针对的是何种内皮细胞表面的抗原分子尚不清楚。角蛋白(Keratin，KRT)是存在于上皮细胞并具有一定物理化学性质的蛋白质。根据角蛋白呈电中性时的pH值(等电点)将其分为I型(酸性)和II型(碱性)。在人类中，I型角蛋白包括KRT9-KRT23、KRT25-KRT28和KRT31-KRT38；II型角蛋白包括KRT1-KRT8、KRT71-KRT80和KRT81-KRT86。角蛋白1(genebankID：3848)是上皮细胞中重要的蛋白质，与角蛋白10组成的异二聚体是组成中间纤维的重要组分，在维持细胞核组织的形态中发挥重要作用。角蛋白1主要表达在基底上皮细胞，在血管内皮细胞，如毛细血管内皮细胞、静脉、动脉的内皮细胞也能检测到角蛋白1的表达。角蛋白1不仅在维持细胞核组织的形态中起着至关重要的作用，而且还参与了受体识别、信号传导，通过血管内皮细胞的氧化应激触发凝集素补体途径等生物学过程。本发现的线索来自临床肾移植病人存在有抗人体血管内皮细胞表面特异性抗体，这类病人常出现移植肾功能缺失。可以应用从这类病人血清中纯化出来的抗体来鉴定其作用的抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种与移植排斥相关的人体血管内皮细胞新的移植抗原及其应用，为探究临床器官移植排斥发生的原因与如何预测排斥反应的发生提供新的研究目标，为建立新的移植排斥评估和诊断体系提供检测试剂。本专利技术提供了一种与临床器官移植排斥相关的人体内皮细胞抗原为角蛋白1(Keratin1，KRT1)。本专利技术还将检测角蛋白1抗体的试剂用于制备评估和诊断移植排斥风险和状况的制剂。本专利技术还提供一种评估和诊断移植排斥状况的试剂盒，检测人体血清中角蛋白1抗体的试剂盒。本专利技术的抗原的筛选、鉴定与验证，包括步骤如下：(1)临床样本的筛选：肾移植病人血清首先用随机的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)流式细胞检测AECAs，再用HLA抗体检测试剂盒和MICA抗体检测试剂盒进行HLA抗体和MICA抗体的检测，符合以下条件的血清作为下一步的研究标本：(1)血清肌酐水平>400umol/L，(2)随机的HUVEC流式交叉试验反应阳性，(3)抗HLA或MICA抗体阳性，或HUVEC阳性。(4)C4d的染色阳性。针对有HLA抗体存在的样本，用人体血小板试剂吸收血清中的HLAI类抗体，吸收后的血清再做抗体测试证实HLAI类抗体已经去除，同时避免使用含有MICA抗体的血清标本。挑选出的不含HLA抗体和MICA抗体的样本分别和来自不同个体的体外分离培养的HUVEC进行细胞流式反应，筛选出可能含有血管内皮细胞特异性抗体的血清样本。(2)免疫沉淀法捕获抗内皮细胞抗体相应的抗原：筛选出的血清样本与体外分离培养的HUVEC进行孵育，富集特异性抗体后收集细胞沉淀。进行细胞裂解处理，在裂解液中加入蛋白A免疫微珠，待蛋白A免疫微珠与裂解液中抗原-抗体复合物充分反应后，加入酸性洗脱缓冲液将蛋白A免疫微珠表面的抗原-抗体复合物洗脱；(3)应用质谱技术鉴定捕获的抗原编码基因：步骤(2)洗脱下来的抗原抗体复合物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染的方法显色，被特异性抗体捕获到的相应的免疫沉淀物与胶一起取出，应用蛋白质质谱技术对该抗原的编码基因进行鉴定；(4)对鉴定的新移植抗原的验证：以含有血管内皮细胞特异性抗体的血清作为抗体对经过基因工程表达的角蛋白1重组蛋白进行免疫印迹反应，还原抗体与特定抗原的结合反应。将所述的筛选和验证方法用于为研究临床与移植排斥相关预测及检测试剂盒。本专利技术的技术方案是基于抗原抗体相互作用的基本原理，对特异性抗原以免疫沉淀的方法来捕获，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳展示，并进行蛋白质质谱鉴定。本专利技术的优势在于首次发现大量肾移植排斥的病人血清与人体血管内皮细胞表面的角蛋白1有抗原抗体反应，与体液排斥反应相关。为深入研究临床器官移植排斥的抗原因素提供新靶标；为完善器官移植临床配型试验和方案提供一种新的移植抗原作为检测试剂。附图说明图1免疫沉淀过程流程图；图2洗脱的抗原-抗体复合物经SDS-PAGE后的银染结果；与健康正常人血清相比，移植受者血清中捕获到人体血管内皮细胞特异性抗原；图3对鉴定的移植抗原的验证；以人群中频率最高的三种角蛋白1的重组蛋白作为抗原，以含有内皮细胞抗原的肾移植病人血清和健康正常人血清作为抗体进行免疫印迹实验，结果显示肾移植病人血清确实存在抗内皮细胞抗原角蛋白1的抗体。具体实施方式：以下是本专利技术的具体实例，进一步描述本专利技术，但是本专利技术不仅限于此。实施例试剂来源：M199培养基、血管内皮生长因子、胶原蛋白酶、胎牛血清、蛋白A微球珠为商品化产品，购自Invitrogen公司；混合健康人血小板试剂购自Sigma公司；HLA抗体检测试剂盒购自OneLambda公司；MICA抗体检测试剂；蛋白质质谱鉴定由华大基因完成。临床样本的筛选肾移植病人血清首先用随机的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)流式细胞检测AECAs，再用HLA抗体检测试剂盒和MICA抗体检测试剂盒进行HLA抗体和MICA抗体的检测，符合以下条件的血清作为下一步的研究标本：(1)血清肌酐水平>400umol/L，(2)随机的HUVEC流式交叉试验反应阳性，(3)抗HLA或MICA抗体阳性，或HUVEC阳性。(4)C4d的染色阳性。针对有HLA抗体存在的样本，用人体血小板试剂吸收血清中的HLAI类抗体，吸收后的血清再做抗体测试证实HLAI类抗体已经去除，同时避免使用含有MICA抗体的血清标本。挑选出的不含HLA抗体和MICA抗体的样本分别和来自不同个体的体外分离培养的HUVEC进行细胞流式反应，筛选出可能含有血管内皮细胞特异性抗体的血清样本。免疫沉淀法捕获抗内皮细胞抗体相应的抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与临床器官移植排斥相关的人体内皮细胞抗原为角蛋白1(Keratin 1，KRT1)。

【技术特征摘要】
1.一种与临床器官移植排斥相关的人体内皮细胞抗原为角蛋白1(Keratin1，KRT1)。2.检测角蛋白1抗体的试剂用于制备评估和诊断移植排斥风险和状况的制剂。3.一种评估和诊断移植排斥状况的试剂盒，其特征在于，是检测人体血清中角蛋白1抗体的试剂盒。4.一种与移植排斥相关的内皮细胞抗原的筛选方法，其特征在于，包括步骤如下：(1)临床样本的筛选：挑选出的不含HLA抗体和MICA抗体的血清样本分别和来自不同个体的体外分离培养的人脐带静脉内皮细胞进行细胞流式反应，筛选出可能含有抗血管内皮细胞特异性抗体的血清样本；(2)免疫沉淀法捕获抗内皮细胞抗体相应的抗原：筛选出的血清样本与体外分离培养的人脐...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹义洲，郭旭丽，胡娟，罗伟光，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43