从含二硫化物的蛋白质制备缀合物的方法技术

本发明专利技术提供了从具有至少四个可接近的半胱氨酸残基的蛋白质制备蛋白质缀合物的方法。在一个实施方案中，具有四个可还原的二硫键的抗体被还原而提供四对游离半胱氨酸。每对游离半胱氨酸与1,3‑二卤代丙酮或类似的反应物反应，将每对的硫原子通过带有反应性酮基的3个碳的连接臂连接在一起。每对这类反应性酮与单个有效载荷分子连接在一起并用于携带有效载荷分子，从而将抗体与两个有效载荷基团缀合。该方法给出了稳定的抗体缀合物，其具有对每个抗体两个有效载荷的比例的高选择性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
已将各种各样的化学部分(“有效载荷(payloads)”)共价连接到酶、抗体以及其它多肽或蛋白质中，以形成缀合物。有效载荷可用来定位它们所连接的蛋白质(例如，标签)、修饰蛋白质的物理化学性质或稳定性(例如聚乙二醇化)、使蛋白质连接到另一分子或蛋白质(用于连接缀合物至另一化合物或另一缀合物的官能团或偶联基团)、或修饰有效载荷或蛋白质的功能或活性(例如疫苗缀合物)。蛋白质也可作为载体来递送所连接的有效载荷至特定组织或细胞类型中，例如在抗体-药物缀合物(ADC)中。可以有用地连接至蛋白质的有效载荷的类别包括可检测部分(标签)、使蛋白质连接到表面或另一化合物的锚定部分(moieties)、与蛋白缀合时引起免疫应答的抗原、与化学互补的偶联配偶体很容易反应(因此将蛋白连接至另一实体)的偶联基团、以及治疗性部分如细胞毒素和其它生物活性剂。以受控和可重复的方式将这些不同的结构连接在蛋白质上对于缀合物正确地发挥其功能是很关键的，特别是当它们用作治疗剂时。在ADC中，例如，小心地控制连接到抗体的载荷化合物数目是非常重要的，这并不容易，因为载体是大且复杂的蛋白质。例如，根据具体靶点、连接体和细胞毒素，ADC的最佳DAR(药物与抗体的比例)可以在1到6或更高的范围内变化，以平衡各类因素如效力、稳定性和安全性。如果ADC以不同的药物/抗体比例(DAR)制备成混合物，分离会很困难，而且由于治疗和监管的原因，产品的一致性很重要。因此，需要制备具有药物-抗体比例的良好控制以及有效缀合和一致的载荷连接点位置的ADC的方法。已经开发了用于将有效载荷连接至蛋白质以克服一些此类问题的许多方法。例如，参见Sletten,E.M.和Bertozzi,C.R.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,6974–6998；Basle′,E.；Joubert,N.；Pucheault,M.Chemistry&Biology2010,17,213-227；和Hermanson,G.T.BioconjugateTechniques,第二版；AcademicPress:SanDiego,CA,2008。最常见的缀合方法依赖于天然存在于许多天然蛋白质中的某些氨基酸的化学反应性：经常使用赖氨酸和半胱氨酸，因为它们提供了将有效载荷连接至蛋白质的反应性位点。蛋白质经常具有比要连接的有效载荷的最佳数目更多的赖氨酸，但是：加入足够的有效载荷部分来占据所有可利用的赖氨酸，以产生一致、同质的产物，这可能会添加对于最佳疗效而言过多的有效载荷分子，同时，部分的负载一般将提供异质产物，这可能会由于多种原因而产生问题，例如在第一个商业化ADC，即MylotargTM的情况下，ADC产物的异质性看来可能已经导致决定撤回该产品注册的问题。Fuenmayor等,Cancers,vol.3,3370-93(2011)。天然蛋白质中半胱氨酸存在的频率比赖氨酸的低，并且当其以足够数量存在时，半胱氨酸可能适合用作缀合位点；当存在太少半胱氨酸时，可通过标准的蛋白修饰方法插入一个或多个。然而，通常优选避免通过插入半胱氨酸或通过除去二硫化物来修饰天然蛋白质序列。虽然通过还原二硫键使该二硫化物转变成两个游离半胱氨酸并不困难，但这样做可能会破坏蛋白质的二级或三级结构。已经报道了在通过还原蛋白质中的二硫化物而形成的半胱氨酸残基之间插入连接臂(tether)的一些方法。该方法对于ADC制备而言特别有吸引力，因为通常的抗体结构包含4个可还原的链间二硫键，其可以在不进行蛋白质工程的情况下应用。一个用于此类缀合的方法涉及砜取代的甲基丙烯酸酯衍生物。US2006/0210526。该方法形成反应性中间体，其在第二个硫原子的烷基化发生之前需要消除步骤。用于该多步骤方法的条件可能会导致半胱氨酸之间连接体(连接臂)的不完全形成，并且这些反应条件可导致蛋白质变性。另一方法使用马来酰亚胺衍生物，例如3,4-二溴马来酰亚胺。WO2011/018613。然而，该方法形成的缀合物可存在稳定性问题，因为马来酰亚胺环上的硫醇的迈克尔加成是可逆的，所以在硫原子之间的或有效载荷本身的连接臂可能会丢失。因此，需要将二硫化物基团转变为缀合位点但又不需要放弃链间二硫键的稳定作用的新方法，同时该方法还提供有效的缀合、稳定性和一致的有效载荷/蛋白质比例。本专利技术提供了制备这类ADC的有利方法。专利技术概述在一个方面，本专利技术提供了一种方法，其使用在抗体上的两个二硫化物将有效载荷链接到蛋白质，形成蛋白质缀合物。该方法包括还原二硫化物，以提供游离的硫羟基，并用桥连基团将这两个硫羟基系在一起，所述桥连基团使它们保持在与它们形成二硫化物时所占据的大致相同的位置上。保持半胱氨酸基团在它们大致相同的位置能够最小化二硫化物还原时可能发生的对蛋白质构象的任何不利影响。被引入以便将两个硫羟基连接在一起的连接臂含有可用于连接所关注的有效载荷的反应性官能团。在一些实施方案中，连接臂含有羰基，所述羰基具有与羟胺基团形成肟连接的足够反应性，并且通过形成这样的连接而将有效载荷缀合到活化的蛋白质上。例如，还原的蛋白质可以与1,3-二卤代丙酮如二氯丙酮或二溴丙酮反应，从而插入将两个硫原子连接在一起的3-碳连接臂。这可适当地模拟二硫键的效果，将蛋白质保持为与二硫化物存在时具有的构象非常相似的构象，同时它还提供了比二硫化物更好的稳定性以及连接有效载荷的位置。在本专利技术方法和组合物中所用的连接臂提供了化学反应性官能团，含有在两个半胱氨酸硫原子之间的这类连接臂的蛋白质在本文中称为活化的蛋白质。尽管每个酮都可以用于连接有效载荷，但在本专利技术中，两个此类的酮或其他连接臂基团与桥连基团连接在一起，桥连基团提供了有效载荷的新的连接点。由于使用两个S-S连接臂来连接携带一个有效载荷的桥连基团，因此在给定多肽上的载荷化合物的数目是该缀合方法中所用的二硫化物数目的二分之一。本文的附图提供了本专利技术缀合物的图示。WO/2014/083505和PCT/IB2014/066300中描述了使用二硫化物形成缀合物的其他方法。WO/2014/083505和PCT/IB2014/066300的全部内容以及其优先权文本都清楚地引入本文作为参考，用于所有目的。这些方法可以用于具有两个或更多个可接近的二硫键的任何蛋白质，并且通常可用于分子量高于500Da以及典型地高于2,000Da的天然蛋白质，其中二硫化物存在于该蛋白质的天然或活化形式中。这些方法可以用于含有一个以上的二硫化物、例如2-10或典型地最多6个二硫化物基团的蛋白质，其中至少有两个二硫化物基团是可足够接近的，以便被常规的二硫化物还原剂还原。这些方法产生含有每对所利用的二硫化物基团上至少一个有效载荷的缀合物，并且该缀合物基本上保持了蛋白质的天然或活化构象。附图简述图1是举例说明二硫化物怎样能够活化和用于制备多肽-有效载荷缀合物的图。图2提供了普通抗体的图解，说明了链间二硫键的存在和位置，其可用于本专利技术形成缀合物的方法。图3A、3B和3C表示具有二硫化物的抗体亚基，所述二硫化物随后用于形成活化的多肽以及本专利技术的多肽-有效载荷缀合物。图4显示了Fc、12和14(实施例1)的SDS-PAGE胶。图5显示了实施例2的产品本文档来自技高网...

【技术保护点】
多肽‑有效载荷缀合物，其包含：其中，圆圈表示多肽或多肽复合物，其可以包含所显示的修饰以外的修饰；每个S是多肽或多肽复合物的半胱氨酸残基的硫原子；T1和T2各自表示连接臂，其将两个硫原子通过1‑5个碳原子连接在一起，其中T1还连接L1，并且T2还连接L2；L1和L2各自表示连接基团，它们分别将T1或T2连接到A；L3是连接基团，其将A连接到R；A表示连接L1、L2和L3的基团；且R表示有效载荷或者用于连接有效载荷的反应性官能团。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.23 US 62/002,5851.多肽-有效载荷缀合物，其包含：其中，圆圈表示多肽或多肽复合物，其可以包含所显示的修饰以外的修饰；每个S是多肽或多肽复合物的半胱氨酸残基的硫原子；T1和T2各自表示连接臂，其将两个硫原子通过1-5个碳原子连接在一起，其中T1还连接L1，并且T2还连接L2；L1和L2各自表示连接基团，它们分别将T1或T2连接到A；L3是连接基团，其将A连接到R；A表示连接L1、L2和L3的基团；且R表示有效载荷或者用于连接有效载荷的反应性官能团。2.权利要求1的多肽-有效载荷缀合物，其中所述多肽是抗体或抗体Fc。3.权利要求2的多肽-有效载荷缀合物，其中T1和T2各自包含连接所连硫原子的具有三个碳原子的链。4.权利要求1的多肽-有效载荷缀合物，其中T1表示式–CH2-C(＝N-O-[L1])-CH2-的基团，其中[L1]表示T1与L1的连接点。5.权利要求4的多肽-有效载荷缀合物，其中T2表示式–CH2-C(＝N-O-[L2])-CH2-的基团，其中[L2]表示T2与L2的连接点。6.权利要求5的多肽-有效载荷缀合物，其中L1和L2相同。7.权利要求6的多肽-有效载荷缀合物，其中所述多肽是抗体或抗体Fc，并且连接到T1的两个硫原子在未缀合的抗体或抗体Fc中形成二硫键。8.权利要求7的多肽-有效载荷缀合物，其中所述多肽是抗体或抗体Fc，并且连接到T2的两个硫原子在未缀合的多肽中形成二硫键。9.权利要求8的多肽-有效载荷缀合物，其中R表示治疗剂、可检测的标签、抗原或结合基团。10.权利要求9的多肽-有效载荷缀合物，其中R表示细胞毒素。11.权利要求10的多肽-有效载荷缀合物，其中A是N、CH、苯基、C3-6环烷基或具有最多2个选自N、O和S的杂原子作为环原子的5-6元杂环基或杂芳基。12.权利要求11的多肽-有效载荷缀...

【专利技术属性】
技术研发人员：QY·胡，M·艾伦，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH