对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用。该重组山冈单胞菌通过赋予受体山冈单胞菌血红蛋白活性来制备，所述受体山冈单胞菌为不具有血红蛋白活性的山冈单胞菌；所述受体山冈单胞菌和所述重组山冈单胞菌对链核盘菌具有抑制活性，在抑制链核盘菌的活性上，所述重组山冈单胞菌高于所述受体山冈单胞菌。该重组山冈单胞菌具有比受体山冈单胞菌更高的抗菌活性，重组山冈单胞菌对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌活性是受体山冈单胞菌的2.3倍。本发明专利技术的重组山冈单胞菌抑菌能力显著提高，可以应用于桃褐腐病生防制剂开发中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域中对链核盘菌具有抑制活性的重组山冈单胞菌及其构建方法与应用。
技术介绍
由链核盘菌(Moniliniaspp.)引起的褐腐病是桃生产中最重要的病害之一，也是世界范围内核果类最重要的采后病害。此病在采前、采后及贮藏运输期均可造成大量减产，采后尤为严重，在欧美损失高达59-90％。我国桃产量在1000万吨以上，为仅次于苹果的第二大水果。调查表明，北京地区此病能够造成贮藏库果实年损失近1/4，出库后烂果率高达84.6-100％。迄今为止，化学防治是控制桃褐腐病的主要手段，今年桃褐腐病生产上常用的桃褐腐化学杀虫剂产生了抗药性，使得此病的防治受到了极大的威胁；此外，由于化学药剂所造成的环境污染、食品安全和人类健康问题，绿色防控已经逐渐成为热点。微生物制剂具有靶标特异性强、对人畜安全、环境兼容等优点，是非常理想的化学药剂代替品。草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004是从西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分离得到的对桃褐腐病菌具有特异的抑菌作用的天然菌株(CN104004680B)，为了进一步提高该菌株的生防活性，开发防效更好的桃褐腐生防制剂，需要研发抗菌活性更高的新菌株。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是如何构建对植物褐腐病具有更高抑菌活性的菌株。为了解决以上技术问题，本专利技术提供了重组山冈(岗)单胞菌。本专利技术所提供的重组山冈(岗)单胞菌，通过赋予受体山冈(岗)单胞菌血红蛋白活性来制备；所述受体山冈(岗)单胞菌和所述重组山冈(岗)单胞菌对链核盘菌具有抑制活性，在抑制链核盘菌的活性上，所述重组山冈(岗)单胞菌高于所述受体山冈(岗)单胞菌。上述重组山冈单胞菌中，所述受体山冈单胞菌可为不具有血红蛋白活性的山冈(岗)单胞菌。上述重组山冈单胞菌中，所述赋予受体山冈单胞菌血红蛋白活性通过将血红蛋白的编码基因导入所述受体山冈单胞菌中实现。上述重组山冈单胞菌中，所述血红蛋白可为如下A1)或A2)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1的蛋白质；A2)将序列表中SEQIDNo.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有血红蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质。其中，SEQIDNo.1由146个氨基酸残基组成。上述重组山冈单胞菌中，所述受体山冈单胞菌可为草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonaspratensis),其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.9193。上述重组山冈单胞菌中，所述血红蛋白的编码基因可为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：A11)编码序列为序列表中SEQIDNo.2的cDNA分子或基因组DNA；A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；A13)与A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA。其中，SEQIDNo.2由441个核苷酸组成。上述重组山冈单胞菌中，所述链核盘菌可为植物褐腐病菌。所述植物的果实为核果，如桃。植物褐腐病菌具体可为美澳型核果链核盘菌(Moniliniafructicola)。上述重组山冈单胞菌中，所述重组山冈(岗)单胞菌可为草甸山冈单胞菌(Collimonaspratensis)，其菌株号为ZV261，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.13015。为解决以上技术问题，本专利技术提供了含有所述重组山冈(岗)单胞菌或/和所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物的菌剂，所述菌剂对链核盘菌具有抑制活性。。上述菌剂的活性成分可为所述重组山冈(岗)单胞菌或/和所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对链核盘菌的抑制效果确定。所述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。上文中，所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物可从所述重组山冈(岗)单胞菌的发酵液中获得。所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物具体可按照如下方法制备：在液体培养基中培养所述重组山冈(岗)单胞菌，除去液体培养物(发酵液)中的所述重组山冈(岗)单胞菌即得到所述重组山冈(岗)单胞菌的代谢物。本专利技术还提供了构建上述重组山冈单胞菌的方法。本专利技术所提供的构建重组山冈单胞菌的方法，包括将血红蛋白的编码基因导入受体山冈单胞菌中，得到抑制链核盘菌的活性高于所述受体山冈单胞菌的重组山冈单胞菌。上述方法中，所述血红蛋白可为如下A1)或A2)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1的蛋白质；A2)将序列表中SEQIDNo.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有血红蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质。上述方法中，所述受体山冈单胞菌可为草甸山岗(冈)单胞菌(Collimonaspratensis),其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.9193。上述方法中，所述血红蛋白的编码基因为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：A11)编码序列为序列表中SEQIDNo.2的cDNA分子或基因组DNA；A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；A13)与A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA。上述方法中，所述链核盘菌可为植物褐腐病菌。所述植物的果实为核果，如桃。植物褐腐病菌具体可为美澳型核果链核盘菌(Moniliniafructicola)。上述方法中，所述重组山冈(岗)单胞菌可为草甸山冈单胞菌(Collimonaspratensis)，其菌株号为ZV261，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.13015。在下文中简称草甸山冈单胞菌(Collimonaspratensis)ZV261。上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂的下述任一应用也属于本专利技术的保护范围：A)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在制备植物褐腐病菌抑制剂中的应用；B)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在抑制植物褐腐病菌中的应用；C)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在制备植物褐腐病抑制剂中的应用；D)上述重组山冈(岗)单胞菌或上述菌剂在抑制植物褐腐病本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组山冈单胞菌，所述重组山冈单胞菌通过赋予受体山冈单胞菌血红蛋白活性来制备；所述受体山冈单胞菌和所述重组山冈单胞菌对链核盘菌具有抑制活性，在抑制链核盘菌的活性上，所述重组山冈单胞菌高于所述受体山冈单胞菌。

【技术特征摘要】
1.重组山冈单胞菌，所述重组山冈单胞菌通过赋予受体山冈单胞菌血红蛋白活性来制备；所述受体山冈单胞菌和所述重组山冈单胞菌对链核盘菌具有抑制活性，在抑制链核盘菌的活性上，所述重组山冈单胞菌高于所述受体山冈单胞菌。2.根据权利要求1所述的重组山冈单胞菌，其特征在于：所述赋予受体山冈单胞菌血红蛋白活性通过将血红蛋白的编码基因导入所述受体山冈单胞菌中实现。3.根据权利要求1或2所述的重组山冈单胞菌，其特征在于：所述血红蛋白是如下A1)或A2)的蛋白质：A1)氨基酸序列是序列表中SEQIDNo.1的蛋白质；A2)将序列表中SEQIDNo.1中的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有血红蛋白活性的由A1)衍生的蛋白质。4.根据权利要求1至3中任一所述的重组山冈单胞菌，其特征在于：所述受体山冈单胞菌为草甸山岗单胞菌(Collimonaspratensis),其菌株号为JZB120004，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.9193。5.根据权利要求1至4中任一所述的重组山冈单胞菌，其特征在于：所述血红蛋白的编码基因为下述A11)-A13)中的任一种DNA分子：A11)编码序列为序列表中SEQIDNo.2的cDNA分子或基因组DNA；A12)在严格条件下与A11)限定的DNA分子杂交且编码所述血红蛋白的cDNA分子或基因组DNA；A13)...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴慧玲，刘伟成，刘朝蓬，刘霆，石玲玲，白雪莲，张涛涛，刘德文，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11