一种牛精子获能液及精子体外获能方法技术

本发明专利技术公开了一种牛精子获能液及精子体外获能方法，属于家畜繁殖技术领域。牛精子获能液主要由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO3 2.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O 0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O 0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O 0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA‑Na 0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA 6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡因0.4800mg/mL，肝素0.0500mg/mL，乳酸链球菌素0.025～0.05mg/mL。该获能液能有效保证精子活力、精子质膜完整率、顶体完整率及线粒体活性，保持精子体外获能效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种牛精子获能液，同时还涉及精子体外获能方法，属于家畜繁殖

技术介绍
随着人工授精和体外受精技术的发展，公牛的受精能力已成为影响牛繁殖效率的重要因素(Hoflack等，2006)。而精液品质分析是评估公牛生育潜力的常用程序手段(Rijsselaere等，2002)，因此牛精液品质分析尤为重要(Hoflack等，2007)。同时精液品质的优劣也与母牛的受胎率有紧密联系，它是提高牛繁殖效率的关键因素。影响公牛精液品质的因素诸多，如年龄、营养、季节和获能效果等。而保证精子获能的有效前提是在获能液中添加抑菌剂。目前，在体外获能液中添加的抑菌剂基本都是抗生素类物质。如公布号CN103173406A的专利技术专利公开的一种牦牛精子获能液，由TALP基础液、BSA(6mg/mL)和丙酮酸钠(1.0mM)组成，TALP基础液为：氯化钠100mM、氯化钾3.1mM、氯化钙2.1mM、氯化镁0.4mM、磷酸二氢钠0.29mM、乳酸钠21.6mM、Hepes10mM、碳酸氢钠25mM、抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L链霉素)及余量水。又如公布号CN104059878A的专利技术专利公开的一种适用于兔精子体外获能的培养液，配方为：NaCl6.5453mg/mL、KCl0.2997mg/mL、NaH2PO4·H2O0.1145mg/mL、MgCl2·6H2O0.1057mg/mL、CaCl2·2H2O0.330mg/mL、葡萄糖2.518mg/mL、0.2％酚红4％、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL、碳酸氢钠3.1080mg/mL、丙酮酸钠0.1380mg/mL、肝素20μg/mL、BSA20mg/mL、EGCG10μmol/L及余量水。上述两获能液中均含有抗生素青霉素和链霉素，而抗生素易产生抗性问题，由其引起的副作用已然不容忽视。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛精子获能液。同时，本专利技术还提供一种牛精子体外获能方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种牛精子获能液，主要由以下组分组成：NaCl6.7500mg/mL，KCl0.3000mg/mL，NaHCO32.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡因0.4800mg/mL，肝素0.0500mg/mL，乳酸链球菌素0.025～0.05mg/mL。pH在7.5～7.8范围。优选的，牛精子获能液，主要由以下组分组成：NaCl6.7500mg/mL，KCl0.3000mg/mL，NaHCO32.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡碱0.4800mg/mL，肝素0.0500mg/mL，乳酸链球菌素0.025mg/mL。所述乳酸链球菌素(Nisin)是一种天然防腐剂，高效、安全，无毒副作用，对食品病原菌和腐败微生物具有较强的抑制作用(幸治梅等，2003)，在食品工业领域有着较为广泛的应用。Nisin是从乳酸链球菌发酵产物中提取的一种多肽抗菌类物质，分子量：3354.07，分子式：C143H230N42O37S7。1914年，Mattick和Hirsch首次命名Nisin，并证明该物质能够抑制革兰氏阳性菌。Nisin对人体基本无毒性，能在肠道内降解成氨基酸，并不改变肠道内原生菌落结构及微生态，同时也不与医用抗生素如青霉素、链霉素等产生交叉抗药性。Nisin作为抑菌剂添加到牛精子获能液中，能够替代抗生素发挥抑菌作用，既能保证牛精子体外获能体系的无菌环境，又能维持牛精子获能效率，为体外大量生产廉价胚胎提供保证，且不存在抗生素诸如耐药性、残留性等问题。一种牛精子体外获能方法，包括以下步骤：将解冻的精液与上述获能液混合，于38～39℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养30～60min，即可。所述精液在38～40℃水浴条件下解冻10～15s。所述获能液在与精液混合之前，先于38～39℃、5％CO2、饱和湿度条件下预热平衡1～2h。优选的，于39℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养(如采用上游法处理)45min。本专利技术的有益效果：本专利技术中牛精子获能液能有效保证精子活力、精子质膜完整率、顶体完整率及线粒体活性，保持精子体外获能效果。其中，乳酸链球菌素在获能液中能够发挥抑菌作用，可完全替代抗生素类物质，避免产生耐药性问题。同时，乳酸链球菌素的价格远低于抗生素，仅为抗生素的1/6～1/5，将其用于牛精子获能液生产可大幅降低生产成本，有利于提高畜牧业研发、生产的经济效益。本专利技术中牛精子体外获能方法操作简单、快捷，有利于提高牛体外胚胎的生产质量和效率。附图说明图1为牛精子质膜完整性检测；图2为牛精子顶体完整性检测；图3为JC-1染色检测牛精子线粒体活性；图4为各处理组精子获能液的菌落密度。具体实施方式下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1牛精子获能液，由以下组分组成：NaCl6.7500mg/mL，KCl0.3000mg/mL，NaHCO32.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡因0.4800mg/mL，肝素0.0500mg/mL，乳酸链球菌素0.025mg/mL，余量为溶剂亚沸水，pH7.5。牛精子体外获能方法，包括以下步骤：1)从液氮罐中取出荷斯坦牛冻精，迅速将其投入38℃水浴中解冻15s；2)将解冻后的精液缓慢加入预热平衡(于38℃、5％CO2、饱和湿度CO2培养箱中预热平衡1h)后的获能液试管底部，倾斜45°角，放入38℃、5％CO2、饱和湿度CO2培养箱中上游法处理60min，即可。实施例2牛精子获能液，由以下组分组成：NaCl6.7500mg/mL，KCl0.3000mg/mL，NaHCO32.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡因0.4800mg/mL，肝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛精子获能液，其特征在于：主要由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO3 2.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O 0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O 0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O 0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA‑Na 0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA 6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡因0.4800mg/mL，肝素0.0500mg/mL，乳酸链球菌素0.025～0.05mg/mL。

【技术特征摘要】
2016.10.11 CN 20161088678941.一种牛精子获能液，其特征在于：主要由以下组分组成：NaCl6.7500mg/mL，KCl0.3000mg/mL，NaHCO32.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡因0.4800mg/mL，肝素0.0500mg/mL，乳酸链球菌素0.025～0.05mg/mL。2.根据权利要求1所述的获能液，其特征在于：主要由以下组分组成：NaCl6.7500mg/mL，KCl0.3000mg/mL，NaHCO32.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O0.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓霞，曹平华，文凤云，许常龙，孙俊丽，禹学礼，栗颖华，付诗卉，韩文霞，武花，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41