一种青霉震颤素结合抗原及其抗体的制备与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种青霉震颤素结合抗原及其抗体的制备与应用。采用本发明专利技术的青霉震颤素酶联免疫试剂盒检测青霉震颤素对于青霉震颤素的特异性抗体与青霉震颤素包被原反应的半数抑制量(IC50)为100ng/mL，青霉震颤素的最低检测限为30ng/mL，青霉震颤素与黄曲霉素B1、环匹阿尼酸、呕吐毒素和黄绿青霉素样品的交叉反应率均小于0.1％。本发明专利技术提供的青霉震颤素酶联免疫试剂盒中青霉震颤素的特异性抗体具有高效价、高灵敏性和特异性强的特点，可用于快速、灵敏、简便地检测动物源性食品中青霉震颤素的残留量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域中一种青霉震颤素结合抗原及其抗体的制备与应用。
技术介绍
青霉震颤素(PenitremA)，是一种由特定的曲霉属真菌(Aspergillus)、麦角属真菌(Claviceps)和青霉属真菌(Penicillium)产生的真菌类神经毒素，能够抑制平滑肌钾离子通道，首次从引起羊神经症状的霉败饲料中分离得到，主要侵害中枢神经,使动物出现震颤、惊厥，甚至死亡。目前检测青霉震颤素主要是采用仪器分析方法进行，包括LC-UV、LC-MS和LC-MS-MS等分析方法，但是这些仪器分析方法存在所需设备昂贵，对工作人员技术要求高及检测前期处理步骤繁琐等不足之处，不适用于大量样本的快速分析测定。基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析检测技术是近年来在环境、食品安全检测领域被广泛应用的一种快速方便、高通量、低成本的检测技术，已逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一，建立一种快速、灵敏、准确、简便地检测青霉震颤素残留量的免疫分析检测方法是当前亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何快速、准确、灵敏地检测青霉震颤素的残留量。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒，包括青霉震颤素包被原和青霉震颤素的特异性抗体；所述青霉震颤素包被原是青霉震颤素与载体蛋白1的偶联物；所述青霉震颤素的特异性抗体为以青霉震颤素与载体蛋白2的偶联物为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体；所述载体蛋白1和所述载体蛋白2是相同或不同的载体蛋白。上述检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒中，所述检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒还可包括酶标二抗，所述酶标二抗中的标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或高碘酸钠法交联在二抗上；所述二抗可为抗鼠或抗兔的抗体。上述检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒中，所述青霉震颤素包被原可按照包括如下步骤的方法制备：将青霉震颤素与所述载体蛋白1进行偶联得到所述青霉震颤素包被原；所述免疫原可按照包括如下步骤的方法制备：将青霉震颤素与所述载体蛋白2进行所述偶联得到所述免疫原。上述检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒中，所述偶联通过Mannich反应实现。上述检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒中，所述多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、猪源、兔源或豚鼠源抗体；所述多克隆抗体具体可为鼠多克隆抗体。上述检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒中，所述单克隆抗体可为单克隆杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。上述检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒中，所述载体蛋白1和所述载体蛋白2可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白；具体的，所述载体蛋白1可为血蓝蛋白，所述载体蛋白2可为牛血清白蛋白。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了青霉震颤素结合抗原的制备方法。本专利技术所提供的青霉震颤素结合抗原的制备方法，包括将青霉震颤素与所述载体蛋白1或所述载体蛋白2进行偶联得到青霉震颤素结合抗原，所述青霉震颤素结合抗原为所述青霉震颤素包被原或所述免疫原。青霉震颤素结合抗原的结构如式Ⅰ所示：式Ⅰ中，K表示载体蛋白。上述青霉震颤素结合抗原的制备方法中，所述偶联通过Mannich反应实现。上文中，所述偶联具体可为在甲醛存在的条件下进行的Mannich反应。所述青霉震颤素结合抗原的制备方法还包括对所述青霉震颤素结合抗原进行纯化的步骤。所述青霉震颤素结合抗原的制备方法中，所述纯化可为将所述青霉震颤素结合抗原进行透析。所述青霉震颤素结合抗原的制备方法中，所述透析在pH为7.4、浓度为0.01M的PBS缓冲溶液中进行；所述透析在4℃进行。可作为固定青霉震颤素与载体蛋白的偶联物的载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述1)-3)中任一所述产品：1)任一所述青霉震颤素包被原；2)任一所述免疫原；3)任一所述青霉震颤素的特异性抗体。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述1)-8)中任一所述应用：1)任一所述青霉震颤素包被原在制备青霉震颤素的特异性抗体中的应用；2)任一所述免疫原在制备青霉震颤素的特异性抗体中的应用；3)所述青霉震颤素结合抗原的制备方法在制备青霉震颤素的特异性抗体中的应用；4)任一所述的酶联免疫试剂盒在检测青霉震颤素中的应用；5)任一所述青霉震颤素包被原在检测青霉震颤素中的应用；6)任一所述免疫原在检测青霉震颤素中的应用；7)任一所述青霉震颤素的特异性抗体在检测青霉震颤素中的应用；8)所述青霉震颤素结合抗原的制备方法在检测青霉震颤素中的应用。本专利技术的检测原理为将青霉震颤素包被原吸附于固相载体上，加入样品和青霉震颤素的特异性抗体，再加入酶标二抗，待测样品中残留的青霉震颤素和固相载体上的青霉震颤素包被原竞争结合青霉震颤素的特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中青霉震颤素残留物含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出青霉震颤素的含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的青霉震颤素标准溶液颜色的比较可判断样品的浓度范围。实验证明，采用本专利技术的青霉震颤素酶联免疫试剂盒检测青霉震颤素对于青霉震颤素的特异性抗体与青霉震颤素包被原反应的半数抑制量(IC50)为100ng/mL，青霉震颤素的最低检测限为30ng/mL，青霉震颤素与黄曲霉素B1、环匹阿尼酸、呕吐毒素和黄绿青霉素样品的交叉反应率均小于0.1％。本专利技术提供的青霉震颤素酶联免疫试剂盒中青霉震颤素的特异性抗体具有高效价、高灵敏性和特异性强的特点，可用于快速、灵敏、简便地检测动物源性食品中青霉震颤素的残留量。附图说明图1为青霉震颤素的化学结构式。图2为青霉震颤素结合抗原的质谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中：青霉震颤素标准品为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为P265；黄曲霉素B1标准品为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为A6636；环匹阿尼酸标准品为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为C1530；呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)标准品为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为D0156；黄绿青霉素标准品为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为C2784；牛血清白蛋白为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为A1933；血蓝蛋白为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为H7017；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号分别为F-5881和F-5506。下述实施例中的BALB/c小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品，6-8周龄。下述实施例中的HRP-羊抗鼠IgG为美国Jacksonimmunoresearch公司的产品本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒，包括青霉震颤素包被原和青霉震颤素的特异性抗体；所述青霉震颤素包被原是青霉震颤素与载体蛋白1的偶联物；所述青霉震颤素的特异性抗体为以青霉震颤素与载体蛋白2的偶联物为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体；所述载体蛋白1和所述载体蛋白2是相同或不同的载体蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种检测青霉震颤素的酶联免疫试剂盒，包括青霉震颤素包被原和青霉震颤素的特异性抗体；所述青霉震颤素包被原是青霉震颤素与载体蛋白1的偶联物；所述青霉震颤素的特异性抗体为以青霉震颤素与载体蛋白2的偶联物为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体；所述载体蛋白1和所述载体蛋白2是相同或不同的载体蛋白。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述青霉震颤素包被原按照包括如下步骤的方法制备：将青霉震颤素与所述载体蛋白1进行偶联得到所述青霉震颤素包被原；所述免疫原按照包括如下步骤的方法制备：将青霉震颤素与所述载体蛋白2进行所述偶联得到所述免疫原。3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述偶联通过Mannich反应实现。4.根据权利要求1-3中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、猪源、兔源或豚鼠源抗体。5.根据权利要求1-4中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白1和所述载体蛋白2为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白。6.根据权利要求1-5中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述载体蛋白1为血蓝蛋白；所述载体蛋白2为牛血清白蛋白。7.青霉震颤素结合抗原的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王战辉，张素霞，史为民，曹明慧，杨慧娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11