本发明专利技术公开了用于凝血酶检测的纸基适体荧光传感器的构建。在计算机上利用Adobe illustrator CS4软件设计微流控纸芯片的疏水蜡打印图案；在纸芯片工作区域生长金铂双金属降低背景荧光信号；修饰适配体1于金钯双金属上用于特异性识别目标物；通过适配体2对凝血酶的特异性结合，荧光标记物被引入到工作区域，进而通过荧光仪实现对凝血酶的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纸芯片技术、荧光检测技术，更具体地说是基于适配体对目标物的特异性结合特性构建了一个用于凝血酶检测的简单、灵敏的纸基荧光传感器。
技术介绍
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,在止血、血管生成和肿瘤生长和转移的诊断等分子生物学中有着重要作用。由于其在生物学的重要性,凝血酶的检测分析包含各种技术比如比色、表面增强拉曼光谱和表面等离子体共振等。各种基于电化学、光致电、电化学发光和其他分析的适体传感器已广泛应用于各种生物分子的检测。与传统的分子识别体系相比,寡核苷酸适配子因合成简单，便于标记，较强的稳定性，广泛的实用性等优点具有很强的竞争力。为了提高凝血酶检测的灵敏度，贵金属复合纳米材料因其比表面积大、生物相容性好等优势在科学
引起了很大的关注。长有这种贵金属复合纳米材料的纸芯片，不仅增加了纸芯片的比表面积，而且有效降低了纸的背景荧光，因而广泛应用于各种类型的生物传感器中。近几年，量子点因其制备过程简单，生物相容性好，激发光谱较宽，对称性高的发射光谱，具有抗漂白性等优点。使其被广泛地用作生物标记材料。用量子点代替有机荧光标记材料，可以大大减少成本，提高检测地灵敏度。同时选用生物相容性非常好地多孔氧化锌作为载体，大孔结构大大提高了该体系中量子点的负载量，从而进一步提高检测灵敏度。自2007年以来，纸基传感器因其低成本，大比表面积，易折叠、处理、成型，生物相容性好等特点被应用于临床诊断的研究。我们利用纸的可折叠性将其折成理想的构象，并且利用纸纤维的毛细管现象，水可以自发流动避免了泵的引入起到真正意义上的装置简化。通过对纸芯片的合理设计和裁剪，结合适配体和凝血酶的特异性结合构建了一个简单、灵敏的纸基荧光传感器。
技术实现思路
本专利技术的目的是充分利用纸的可折叠性和毛细管现象及AuPt合金纳米粒子的优良性能制备一种新型的纸基荧光分析器件，并结合适配体的特异性识别功能实现方便快捷地高灵敏检测凝血酶。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下措施来实现的：（1）在计算机上设计如附图1所示的纸芯片疏水蜡打印图案；（2）将步骤（1）中设计的打印图案通过蜡打印机打印在已裁剪为A4大小的色谱纸上，然后将带有蜡图案的A4色谱纸通过加热到125ºC的平板加热器加热2min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；（3）在步骤（2）中得到的色谱纸的工作区域进行功能化，生长AuPt双金属后进行适配体1的修饰，滴加50μL待检测的凝血酶，反应45min后用磷酸缓冲溶液清洗后用牛血清白蛋白封锁非活性位点；（4）在步骤（2）中得到的色谱纸的孵化区域滴40μL合成好的QDs@ZnO荧光标记物和60μL的1µM适配体2，进行荧光标记和适配体2的反应；（5）将纸芯片沿着折叠线折叠，连有适配体2的荧光标记物QDS@ZnO在纸纤维的毛细作用力下通过流体到达工作区域，反应30min后用磷酸缓冲溶液洗涤：（6）将步骤（5）中纸芯片工作区放入荧光设备中，在340nm的激发波长下进行荧光测定，绘制荧光强度与凝血酶的浓度关系，实现对凝血酶的精确检测。本专利技术所述的对纸芯片的亲水区域功能化的步骤为：对色谱纸的工作区域进行功能化地具体步骤为：用移液枪量取100μL金纳米粒子滴于亲水的工作区域，然后在室温下自然干燥，重复5次，二次水洗涤，室温下干燥静置；将1.0mL1wt%氯金酸水溶液和2.5mL1%氯铂酸溶液快速混匀，移液枪量取60μL混合液滴加到工作区域，然后用移液枪迅速量取40μL新鲜配制的1wt%柠檬酸钠水溶液滴到工作区域，反应30min后用二次水冲洗，然后用移液枪量取100μL1µM适配体1滴于工作区域孵化1h,用pH为7.4磷酸缓冲溶液清洗三次后用1%的牛血清白蛋白溶液封锁非活性位点。本专利技术所述的QDs@ZnO的制备步骤为：称取0.3g炭黑溶于60mL6M硝酸中，超声2h后在120°C条件下回流24h，将上述溶液降到室温后离心并干燥，然后将产物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子点;称取3.5g可溶性淀粉溶于80mL沸水中，在85ºC下搅拌5min后加入6mmol六水合硝酸锌，通过逐滴加入氢氧化钠将溶液pH调至8-9后继续加热30min，然后将获得的沉淀离心、洗涤并在500ºC下焙烧2h获得多孔氧化锌，称取0.6g获得的多孔氧化锌溶于0.1mM的对巯基苯胺溶液中搅拌4h；移液枪量取500μL合成好的量子点与2mL功能化的氧化锌混合后在10mg·mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和20mg·mL-1的N-羟基丁二酰亚胺作用下反应30min，离心，洗涤后溶于3mL磷酸缓冲溶液中。本专利技术的有益效果（1）荧光探针的合成方法简单，生物相容性好。（2）利用适配体技术，避免了传统的抗原抗体识别方法。（3）本专利技术所述的方法检测成本低廉、操作简单、灵敏度高。附图1：纸芯片的尺寸和形状。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施。实施例1：纸基适体荧光传感器用于凝血酶检测，其特征是包括以下步骤：（1）在计算机上设计如附图1所示的纸芯片疏水蜡打印图案；（2）将步骤（1）中设计的打印图案通过蜡打印机打印在已裁剪为A4大小的色谱纸上，然后将带有蜡图案的A4色谱纸通过加热到125ºC的平板加热器加热2min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；（3）在步骤（2）中得到的色谱纸的工作区域进行功能化，用移液枪量取100μL金纳米粒子滴于亲水的工作区域，然后在室温下自然干燥，重复5次，二次水洗涤，室温下干燥静置；将1.0mL1wt%氯金酸水溶液和2.5mL1%氯铂酸快速混匀，移液枪量取60μL混合液滴加到工作区域，然后用移液枪迅速量取40μL新鲜配制的1wt%柠檬酸钠水溶液滴到工作区域，反应30min后用二次水冲洗，然后用移液枪量取100μL1µM适配体1滴于工作区域孵化1h,用pH为7.4磷酸缓冲溶液清洗三次后用1%的牛血清白蛋白溶液封锁非活性位点；（4）在步骤（2）中得到的色谱纸的孵化区域进行一下操作；用移液枪量取100μL金纳米粒子滴于亲水的工作区域，然后在室温下自然干燥，重复5次，二次水洗涤，室温下干燥静置；将1.0mL1wt%氯金酸水溶液和2.5mL1%氯铂酸快速混匀，移液枪量取60μL混合液滴加到工作区域，然后用移液枪迅速量取40μL新鲜配制的1wt%柠檬酸钠水溶液滴到工作区域，反应30min后用二次水冲洗，然后用移液枪量取100μL1µM适配体1滴于工作区域孵化1h,用pH为7.4磷酸缓冲溶液清洗三次后用1%的牛血清白蛋白溶液封锁非活性位点；（5）将纸芯片沿着折叠线折叠，连有适配体2的荧光标记物QDS@ZnO在纸纤维的毛细作用力下通过流体到达工作区域，反应30min后用磷酸缓冲溶液洗涤；具体步骤为：称取0.3g炭黑溶于60mL6M硝酸中，超声2h后在120°C条件下回流24h，将上述溶液降到室温后离心并干燥，然后将产物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子点;称取3.5g可溶性淀粉溶于80mL沸水中，在85ºC下搅拌5min后加入6mmol六水合硝酸锌，通过逐滴加入氢氧化钠将溶液pH调至8-9后继续加热30min，然后将获得的沉淀离心、洗涤并在500ºC下焙烧2h获得多孔氧化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于凝血酶检测的纸基适体荧光传感器的构建，其特征是包括以下步骤：1.1在计算机上设计如附图1所示的纸芯片疏水蜡打印图案；1.2将步骤1.1中设计的打印图案通过蜡打印机打印在已裁剪为A4大小的色谱纸上，然后将带有蜡图案的A4色谱纸通过加热到125ºC的平板加热器加热2 min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；1.3将步骤1.2中得到的色谱纸的工作区域进行功能化，生长AuPt双金属后进行适配体1的修饰，滴加50μL待检测的凝血酶，反应45 min后用磷酸缓冲溶液清洗，然后用牛血清白蛋白封锁非活性位点；1.4在步骤1.2中得到的色谱纸的孵化区域滴40μL合成好的QDs@ZnO荧光标记物和 60μL的1 µM适配体2，进行荧光标记物和适配体2的反应；1.5将纸芯片沿着折叠线折叠，连有适配体2的荧光标记物QDS@ZnO到达含有目标物的工作区域，反应30 min后用磷酸缓冲溶液洗涤；1.6将步骤1.5中纸芯片工作区放入荧光设备中，在340 nm的激发波长下进行荧光测定，绘制荧光强度与凝血酶的浓度关系，实现对凝血酶的精确检测。
【技术特征摘要】
1.一种用于凝血酶检测的纸基适体荧光传感器的构建，其特征是包括以下步骤：1.1在计算机上设计如附图1所示的纸芯片疏水蜡打印图案；1.2将步骤1.1中设计的打印图案通过蜡打印机打印在已裁剪为A4大小的色谱纸上，然后将带有蜡图案的A4色谱纸通过加热到125ºC的平板加热器加热2min，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙；1.3将步骤1.2中得到的色谱纸的工作区域进行功能化，生长AuPt双金属后进行适配体1的修饰，滴加50μL待检测的凝血酶，反应45min后用磷酸缓冲溶液清洗，然后用牛血清白蛋白封锁非活性位点；1.4在步骤1.2中得到的色谱纸的孵化区域滴40μL合成好的QDs@ZnO荧光标记物和60μL的1µM适配体2，进行荧光标记物和适配体2的反应；1.5将纸芯片沿着折叠线折叠，连有适配体2的荧光标记物QDS@ZnO到达含有目标物的工作区域，反应30min后用磷酸缓冲溶液洗涤；1.6将步骤1.5中纸芯片工作区放入荧光设备中，在340nm的激发波长下进行荧光测定，绘制荧光强度与凝血酶的浓度关系，实现对凝血酶的精确检测。2.根据权利要求书1所述用于凝血酶检测的纸基适体荧光传感器的构建，其特征在于，在步骤1.3中所述对色谱纸的工作区域进行功能化地具体步骤为：用移液枪量取100μL金纳米粒子滴于亲水的工作区域，然后在室温下自然干燥，重复5次，二次水洗涤，室温下干...
【专利技术属性】
技术研发人员：兰飞飞，梁琳琳，葛慎光，于京华，颜梅，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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