一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法技术

本发明专利技术涉及一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，将日本血吸虫SJFCA基因通过PCR技术扩增出来，然后用表达载体pET‑28a(+)与目的基因进行连接，对基因亚克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中对连接成功的片段进行诱导表达；对表达的重组蛋白SJFCA/His进行纯化，运用Western blot（蛋白质印迹法）的技术方法检测重组蛋白的免疫原性。结果显示它能被小鼠免疫血清识别，具有良好的免疫原性。本发明专利技术是诱导产生细胞毒性T细胞应答的方法之一；稳定性好，大量的变异可能性小，易于质量监控；生产成本较低；可以通过多种质粒的混合物或者构建复杂的质粒来实现多价疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制品的合成制备领域，具体涉及一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法。
技术介绍
日本血吸虫（Schistosomajaponicum）也叫日本分体吸虫，寄生在动物门静脉系统的小血管内，例如：人、某些野生哺乳动物、牛、羊等。除人体外，还有40多种家畜和野生动物自然感染日本血吸虫病，黄牛是所有动物之中感染率最高的，水牛第二。防治血吸虫病的工作比较复杂，因为外界环境与血吸虫病的发生息息相关，目前主要以流行病学为基础，实施综合防治措施相结合的方法，来有效控制或消灭血吸虫病。该病的综合防治措施主要包括:(1)控制传染源：采取一定措施让患血吸虫病的人和家畜很少或者不排出虫卵。目前主要措施为通过药物治疗病人病畜，捕杀患病野生动物。(2)加强对排泄物的管理以及杀卵。目前对粪便的处理常采用粪尿合贮、发酵、建造分隔粪池等方法。(3)中间宿主钉螺的消灭。目前主要有物理方法和化学方法来杀死钉螺。（4）防止感染。日本血吸虫的终末宿主有40多种哺乳动物，目前采取的主要措施为提供安全用水、杀灭尾蚴、研制血吸虫疫苗等。目前，血吸虫病防治仍以药物治疗为主。至今,防治血吸虫病基本药物包括治疗性药物吡喹酮、硝硫氰胺和敌百虫,预防性药物蒿甲醚和青蒿琥酯。中药成分青蒿素及其衍生物也具有抗日本血吸虫的作用等。虽然药物的治疗具有成本低廉、效果显著的特征，但是，某些药物因受到宿主的代谢机制及药理毒理限制而影响其疗效，长期使用某一药物会导致对药物敏感性下降的虫株出现。此外，治疗的药物多少都存在毒副作用，长期使用会影响人畜的健康，而某些药物的疗效受代谢机制和作用机制的影响，会使疗效降低甚至不发挥作用，需使用联合用药才能发挥药效。除此之外，虽然药物治疗能够降低感染率和发病率，但对宿主肝脏形成的肉芽肿并没有作用，再次接触病原后会发生重复感染，这就需要重复的治疗。因此，发展血吸虫疫苗是综合防治血吸虫病的一项具有前瞻性的工作。流行病学的研究表明，人体对血吸虫再次感染具有一定的免疫性保护能力[18]。基因工程疫苗已成为当今我国研究血吸虫病疫苗的主流方向[19]。同时，混合疫苗、多价抗原融合疫苗的构建及其与佐剂的联合使用[20]，新的血吸虫疫苗候选分子的筛选鉴定，及其与不同佐剂的配伍和优化，对疫苗免疫保护效果的提高提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法。基于上述目的，本专利技术采取了如下技术方案：将日本血吸虫SJFCA基因通过PCR技术扩增出来，然后用表达载体pET-28a(+)与目的基因进行连接，对基因亚克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中对连接成功的片段，进行诱导表达。对表达的重组蛋白SJFCA/His进行纯化，运用Westernblot的技术方法检测重组蛋白的免疫原性。结果显示它能能被小鼠免疫血清识别，具有良好的免疫原性。上述的日本血吸虫SJFCA基因克隆，主要是引物的设计与合成，根据GenBank上收录的日本血吸虫SJFCA2593.002|FSA001-P00010-C21核苷酸序，设计PCR引物。上述的一种重组质粒pET-28a(+)-SJFCA的构建与鉴定，其特征在于重组质粒的提取，用限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ将提取的重组T载体质粒及pET-28a(+)空载体双酶切；上所述的重组蛋白rSJFCA的制备，其特征在于根据SDS-PAGE鉴定结果分析重组蛋白表达形式，采用HisBindResin树脂柱层析,分离纯化目的蛋白；上述的Western-blot检测重组蛋白的抗原性，其特征在于其特征在于以纯化的重组蛋白rSJFCA为抗原，用日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作为一抗，进行Westernblotting分析。结果显示该免疫疫苗能被兔子免疫血清识别，具有良好的免疫原性。本专利技术是诱导产生细胞毒性T细胞应答的为数不多的方法之一；可以克服蛋白亚基疫苗易发生错误折叠和糖基化不完全的问题；稳定性好，大量的变异可能性很小，易于质量监控；生产成本较低；可以通过多种质粒的混合物或者构建复杂的质粒来实现多价疫苗；抗原合成稳定性好将减少加强注射剂量，非常少量（有时是毫微克级）的DNA就可以很好的活化细胞毒性T细胞。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细描述，但本专利技术的保护范围并不局限于此。实施例1一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法。具体步骤如下：准备实验材料：6周龄雄性BALB/c小鼠（雄性）、日本血吸虫中国大陆株阳性尾蚴、质粒pMD®19-T、宿主菌DH5α、BL21(DE3)、表达质粒pET-28a(+)、日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清等实验步骤：将小鼠以腹部贴片法接种日本血吸虫尾蚴300条，对培养16天后的小鼠进行剖杀来收集虫体，将收集的小鼠体内的虫体用灭菌的1×PBS充分洗涤，在液氮保存。取一定量的保存于液氮中的日本血吸虫虫体，根据GenBank上收录的日本血吸虫SJFCA2593.002|FSA001-P00010-C21核苷酸序，设计PCR引物，并送到河南省生物工程技术研究中心有限公司合成，引物序列如下：Senseprimer(F1):5'-GCGGATCCATGAGTCTCGTAACTCCT-3'（下划线为BamHⅠ内切酶酶切位点），Antisenseprimer(R1):5'GCGAGCTCTCATTTGAAGCCTAGACG-3'（下划线为SacⅠ内切酶酶切位点），通过PCR技术扩增出来，重组质粒的提取用B型质粒小量快速提取试剂盒。用限制性内切酶BamHⅠ、SacⅠ将提取的重组T载体质粒及pET-28a(+)空载体双酶切，在37℃水浴锅中酶切反应30min。在pET-28a(+)载体中连入我们试验中要的基因片段，构建出重组质粒。在连接仪的16°C条件下连接过夜，然后转入到宿主菌BL21(DE3)中。将单个克隆的菌落挑取出来摇菌进行PCR鉴定，将鉴定成功的单克隆进行测序鉴定。在鉴定成功的阳性克隆的菌液中提取质粒，然后用上述的酶切体系进行鉴定。将测序正确的重组菌液接种于500mL的LB液体培养基中，然后进行摇菌培养，经过重组蛋白rSJFCA的原核表达，根据SDS-PAGE鉴定结果分析重组蛋白表达形式，采用HisBindResin树脂柱层析,分离纯化目的蛋白，以纯化的重组蛋白rSJFCA为抗原，用日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作为一抗，进行Westernblotting分析。Westernblotting显示，免疫抗原血清能识别表达出来的重组蛋白，表明该蛋白抗原性良好，这为进一步的免疫保护实验奠定基础，为新的免疫候选疫苗抗原的研究提供重要依据。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于将日本血吸虫SJFCA基因通过PCR技术扩增出来，然后表达载体pET‑28a(+)与目的基因进行连接，对基因亚克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中对连接成功的片段进行诱导表达、纯化，运用Western blot的技术方法检测重组蛋白的免疫原性。

【技术特征摘要】
1.一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于将日本血吸虫SJFCA基因通过PCR技术扩增出来，然后表达载体pET-28a(+)与目的基因进行连接，对基因亚克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中对连接成功的片段进行诱导表达、纯化，运用Westernblot的技术方法检测重组蛋白的免疫原性。2.根据权利要求1所述的一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于对日本血吸虫SJFCA基因进行引物的设计与合成和目的基因的扩增。3.根据权利要求1所述的一种预防日本血吸虫病免疫疫苗的合成方法，其特征在于对重组质粒pET-28a(+)-SJFCA进行构建与鉴定，对重组蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨燚帆，
申请(专利权)人：杨自标，
类型：发明
国别省市：河南;41