绞股蓝糖基转移酶的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了绞股蓝糖基转移酶的工程菌及其构建方法与应用。所述的绞股蓝糖基转移酶，可以催化原人参二醇合成稀有人参皂苷CK。其名称为UGTGp4。本发明专利技术同时也公开了合成稀有人参皂苷CK的方法与应用。本发明专利技术通过将来自于绞股蓝的糖基转移酶基因在大肠杆菌中异源表达，体外酶促反应进行了功能鉴定。对其产物进行ESI质谱和HPLC检测都显示有较高的信号。本发明专利技术所制备的人参皂苷具有得率高，副产物少，容易工业化生产等优点，为绞股蓝皂苷异源生物合成奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，涉及一种利用大肠杆菌异源表达绞股蓝糖基转移酶在体外合成稀有人参皂苷的方法，同时还涉及该绞股蓝糖基转移酶在合成稀有人参皂苷CK中的应用。
技术介绍
绞股蓝为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，绞股蓝中含有多种药用成分，其中最主要的药效成分为绞股蓝皂苷。绞股蓝皂苷结构为四环三萜达玛烷型，与人参皂苷的结构相同。绞股蓝皂苷由两部分组成，是由苷基与配糖基相结合形成的生物大分子。至今已发现有八种绞股蓝皂苷在结构上与原人参二醇型人参皂苷是完全相同的，且这八种皂苷的总量达到总皂苷的25%左右，而且其中有六种成分其含量高于人参中所对应的相同成分，因此具有广泛的药理作用。绞股蓝皂苷具有多种特殊的药理作用，具有降低血脂、抗肿瘤、降血糖、抗衰老等药理作用，且无抗药性、无副作用。绞股蓝在保健食品和新型药品研发上都有巨大的应用前景，是一种新的药食两用植物资源。研究绞股蓝皂苷的代谢通路，进行皂苷的异源生物合成，从而提高绞股蓝皂苷的产率具有重要意义。目前关于绞股蓝皂苷的研究主要集中在总皂苷水平，对单一皂苷的研究相对较少，通过对底物进行糖基化修饰得到的皂苷具有单一性的特点，且还可得到稀有绞股蓝皂苷。因此，获得大量高纯度的绞股蓝皂苷是当前研究的热点。目前，生产人参皂苷的方法主要是从栽培人参中提取。而人参的生长周期长，且提取人参皂苷的工艺流程复杂、产率低、容易造成环境污染。而糖苷酶法则具备立体选择性、得率高、副产物少且可以得到稀有人参皂苷等优点。被认为是生产稀有人参皂苷最有潜力的方法。随着测序等技术的不断发展，基因库资源不断丰富，本专利技术人努力查明了具有从绞股蓝向人参皂苷转移糖活性的绞股蓝糖基转移酶。且确认所述绞股蓝糖基转移酶UGTGp4对通过糖苷键而与PPD的第20位的葡萄糖具有糖转移活性，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于开发一种糖基转移酶，该糖基转移酶通过糖苷键而与原人参二醇PPD的第20位的葡萄糖具有糖转移活性，从而生成稀有人参皂苷CK。本专利技术人借助于特征序列法，PSPG盒是植物次生代谢产物糖基转移酶的一个标志性的重要特性，可通过PSPG序列来筛选糖基转移酶基因。并结合NCBI等数据库资源，筛选出了可能催化原人参二醇20位羟基糖基化反应的糖基转移酶基因。将初步筛选到的基因在大肠杆菌表达系统中进行表达，纯化得到粗酶液。经实验证明该基因能够催化原人参二醇20位羟基糖基化反应，生成大量、单一的稀有人参皂苷CK。另一方面，本专利技术提供了一种糖基化合成稀有人参皂苷CK的糖基转移酶及其编码的基因。所述糖基转移酶的基因序列为SEQIDNO.4。第三方面，本专利技术提供了一种绞股蓝糖基转移酶蛋白质，其对通过糖苷键而连接在所述PPD类人参皂苷的第20位的葡萄糖具有糖转移酶活性。第四方面，本专利技术进一步提供了一种使用绞股蓝糖基转移酶体外合成人参皂苷CK的方法。该方法以原人参二醇和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，在绞股蓝糖基转移酶的催化下，原人参二醇的第20位羟基发生糖基化，生成稀有人参皂苷CK。实验结果显示：采用本专利技术的合成方法所生成的人参皂苷CK，经处理后纯度可以达到98%。最后，本专利技术还提供了包含编码该绞股蓝糖基转移酶的重组载体，以及该重组载体的转化体。该重组载体为现代技术中的任意的基因的重组载体，例如本实验中用到的pET-28a质粒。该载体融合有六聚组氨酸标签，可利用Ni-NTAHis-结合树脂柱而容易的回收所需的靶蛋白。所述重组载体的转化体，即指的是重组载体的宿主细胞。例如本实验中用到的大肠杆菌E.coliBL21（DE3）（NEB公司）。但是不仅限于此。为实现上述目的本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：一种表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于可以异源表达绞股蓝糖基转移酶，基因工程菌名称为H2494。本专利技术所述表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按照如下步骤进行：1）运用生物信息学方法，通过与已知人参皂苷功能相关糖基转移酶序列进行BLAST对比，预测了能够形成绞股蓝皂苷的糖基转移酶基因，命名为comp20426。2）提取绞股蓝总RNA,通过反转录得到绞股蓝cDNA文库；3）设计特异引物，然后从绞股蓝cDNA文库中扩增得到绞股蓝皂苷糖基转移酶基因comp20426；4）制备含有绞股蓝皂苷糖基转移酶基因comp20426的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；5）将宿主菌大肠杆菌E.coliBL21（DE3）（NEB公司）进行溶源化处理，将步骤4）所获得的重组质粒转化到溶源菌中，获得能够表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌。其中所述构建绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的克隆引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示。本专利技术进一步公开了一种绞股蓝糖基转移酶UGTGp4蛋白质，其特征在于具有将糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD的具有糖转移酶活性的绞股蓝糖基转移酶蛋白质，为SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。本专利技术更进一步公开了绞股蓝糖基转移酶糖基化体外合成CK的方法，其特征在于，以原人参二醇PPD和糖基供体UDP-葡萄糖为底物，在绞股蓝糖基转移酶的催化下，原人参二醇的C20位发生糖基化反应，生成稀有人参皂苷CK。本专利技术公开的SEQIDNO1-4的序列如下：CGGGATCCATGGAAAGAGATGAAAAAGGC（SEQIDNO.1）CCGCTCGAGTTATTTATTGCGGGTAAGTTTG（SEQIDNO.2）MERDEKGKEVHVIVVPFCIQGHINPLLQFSKHLAHKGLKVTLPTIFTHKFNNNTSSTHPSLLTIDQVPLLPYQEPEPEYVSAYWRRHHTSIRVHLTELMTRHQSAGNHVSCIVYDSIMTWVLDIVKQFGVLGASFFTQSCAVNAIYYNYHMGLLNVPLDHNFVLDGFPILHKSDLPLFLVESEKYSSILTLLSHQFSRLNEVDSIFVNTFDRLEQQEVDWMGSKYPFKNIGPMVPSMYLDGQLKDDTDYGLCLCDQNMDSTMNWIHSKPDNSLIYVSFGSMAELGKEQMEEIAWGLKMSNRFFLWVVRESEIQKLPNNFIEETSEKGTVVNWCPQLEVLGHKSIGCFISHCGWNSTLEALSLGVPMVAMPQTSDQPTNAKYVEDVWKVGRRVRVDEGQGIAKREEILLSINEVMEGEKSREIRDNLRKWKELAKQAMDEHGTSNNNINEFVDKLTRNK（SEQIDNO.3）（SEQIDNO.4）ATGGAAAGAGATGAAAAAGGCAAAGAAGTTCATGTAATAGTTGTTCCATTCTGTATCCAAGGTCACATTAACCCATTGCTCCAATTTTCAAAACATCTTGCCCACAAAGGGCTCAAAGTTACACTTCCCACCATTTTCACACACAAATTCAATAACAATACATCATCCACACATCCCTCACTACTCACCATTGATCAAGTTCCTCTTTTGCCATACCAAGAACCTGAGCCTGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于可以异源表达绞股蓝糖基转移酶，基因工程菌名称为H2494。

【技术特征摘要】
1.一种表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于可以异源表达绞股蓝糖基转移酶，基因工程菌名称为H2494。2.权利要求1所述表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按照如下步骤进行：运用生物信息学方法，通过与已知人参皂苷功能相关糖基转移酶序列进行BLAST对比，预测了能够形成绞股蓝皂苷的糖基转移酶基因，命名为comp20426；提取绞股蓝总RNA,通过反转录得到绞股蓝cDNA文库；设计特异引物，然后从绞股蓝cDNA文库中扩增得到绞股蓝皂苷糖基转移酶基因comp61；制备含有绞股蓝皂苷糖基转移酶基因comp20426的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；将宿主菌大肠杆菌E.coliBL21（DE3）进行溶源化处理，将步骤4）所获得的重组质粒转化到溶源菌中，获得能够表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大...

【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，刘斌，许莹莹，徐艳丽，田鑫，黄笛，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12