使用杂交的靶核酸检测制造技术

本发明专利技术提供了使用与阵列的杂交来检测包括混合样品在内的样品中的基因座和基因组区域的检测系统和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请案的交叉引用本国际PCT申请要求2014年8月1日提交的美国专利申请第14/450,144号和2014年8月6日提交的美国专利申请第14/453,396号的权益。
本专利技术涉及从样品中检测靶基因组区域。
技术介绍
在下面的讨论中，将为了背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文所包含的任何内容不得被解释为对现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当时证明基于适用的法定条款本文提及的文章和方法不构成现有技术的权利。遗传异常导致大量的病状，包括由染色体非整倍性引起的病状(例如，唐氏综合征(Downsyndrome))、特定基因中的种系突变(例如，镰状细胞性贫血)和由体细胞突变引起的病状(例如，癌症)。用于确定遗传异常的诊断方法已成为用于鉴定特定疾病和病症以及提供关于疾病来源和治疗选择的宝贵信息的标准技术。拷贝数变异(CNV)是对应于基因组(包括整个染色体)上已经缺失或重复的特定区域的基因组DNA改变。可以通过基因组重排如缺失、重复、倒位和易位引起CNV。CNV已经与多种形式的癌症(CappuzzoF,Hirsch等人(2005)JNatlCancerInst.,97(9):643-55)、神经紊乱，包括孤独症(Sebat,J.等人(2007)Science316(5823):445-9)和精神分裂症(St.Clair,D.,(2008).SchizophrBull35(1):9-12)相关。因此，需要采用有效的可重现性测定和检测系统来筛选拷贝数变异的方法。
技术实现思路
提供本
技术实现思路
以便以简化形式介绍将在以下详细描述中进一步描述的概念的选择。本专利技术内容并不旨在标识所要求保护主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护主题的范围。根据以下撰写的详细描述，包括在附图中图示的以及在所附权利要求中限定的那些方面，所要求保护主题的其他特征、细节、功用和优点将会是明显的。本专利技术提供用于检测样品中的遗传特征，包括拷贝数变异(CNV)、插入、缺失、易位、多态性和突变的方法。本专利技术采用针对每个被探查基因座使用至少两个固定序列寡核苷酸并且经由连接使所述固定序列寡核苷酸直接或间接接合，从而从两个或更多个靶基因组区域探查基因座的技术。来自选定基因组区域内的不同基因座的连接产物包含核酸捕获区域，所述核酸捕获区域被设计为包括与固体支持物上的一个或多个捕获探针互补的区域。所述捕获区域包含一个或多个可检测标记，这些可检测标记将连接产物鉴定为源于特定靶基因组区域。对来自不同靶基因组区域的连接产物的鉴定通过使连接产物的捕获区域与固体支持物上的互补捕获探针结合来实现。在一个具体实施方案中，本专利技术提供了一种用于提供胎儿非整倍性的统计可能性的测定方法，其包括：提供包含母体和胎儿细胞游离DNA的母体样品；使用包含捕获区域的序列特异性寡核苷酸从第一靶基因组区域探查一个或多个基因座；使用包含捕获区域的序列特异性寡核苷酸从第二靶基因组区域探查一个或多个基因座；经由与阵列的杂交来检测来自第一靶基因组区域和第二靶基因组区域的分离的选定基因座；量化分离的基因座的总计数以确定第一靶基因组区域和第二靶基因组区域的相对频率；使用序列特异性寡核苷酸从不同于第一靶基因组区域和第二靶基因组区域的至少一个靶基因组区域探查选定多态性基因座；检测分离的选定多态性基因座；量化分离的选定多态性基因座的总计数以计算母体样品中胎儿细胞游离DNA的百分比；计算母体样品中胎儿非整倍性的统计可能性，其中来自第一靶基因组区域的基因座的相对频率、来自第二靶基因组区域的基因座的相对频率和来自分离的选定多态性基因座的量化计数用于提供胎儿非整倍性的存在的统计可能性。在其他具体实施方案中，本专利技术提供了确定胎儿非整倍性的存在或不存在的测定方法，其包括：提供包含母体和胎儿细胞游离DNA的母体样品；使用包含捕获区域的序列特异性寡核苷酸从第一靶基因组区域探查一个或多个基因座；使用包含捕获区域的序列特异性寡核苷酸从第二靶基因组区域探查一个或多个基因座；经由与阵列的杂交来检测来自第一靶基因组区域和第二靶基因组区域的基因座；量化所述基因座的总计数以确定第一靶基因组区域和第二靶基因组区域的相对频率；以及基于与分离的基因座的预期计数的偏差，使用来自第一靶基因组区域的基因座的相对频率和来自第二靶基因组区域的基因座的相对频率来确定母体样品中胎儿非整倍性的存在或不存在。在某些方面，使用由样品的代表性群体和优选包含来自相似母体年龄和/或孕龄的患者的样品的代表性群体测定的阈值水平来确定与预期计数的偏差。在具体方面，从第一基因组区域和第二基因组区域探查基因座使用杂交，接着是连接。在更具体的方面，扩增步骤是在杂交和连接步骤之后进行。在其他具体方面，扩增是使用聚合酶链式反应的通用扩增。在优选方面，使用具有捕获探针的单个固体载体；例如包含与指示不同靶基因组区域的多个捕获区域互补的捕获探针的阵列，来鉴定来自两个或更多个不同基因组区域的连接产物。将源于两个或更多个不同基因组区域的连接产物的混合物引入到阵列时，具有相同捕获区域的连接产物将与阵列上的互补捕获探针竞争性杂交，并且可以基于与捕获探针结合的检测标记的量估计来自每个基因组区域的连接产物的相对频率。以这种方式，可以确定靶基因组区域本身的相对频率。可通过鉴定对应于来自每个靶基因组区域的每个选定基因座的连接产物上的捕获区域与阵列上的特定已知位置的结合，或通过在源于靶基因组区域的连接产物结合之后估计来自阵列的总荧光量来确定每个靶基因组区域的相对频率。在某些优选的实施方案中，捕获区域和捕获探针并不反映特定靶基因组区域核苷酸序列，而是用作鉴定特定靶基因组区域的替代物的“工程化”序列；因此对应于靶基因组区域的连接产物的核苷酸序列不需要直接确定。使用连接产物上的捕获区域允许连接产物与阵列上的捕获探针结合来指示作为连接产物来源的较大靶基因组区域，而无需为对应于靶基因组区域的实际核苷酸序列的连接产物部分测序。因为捕获区域和捕获探针是工程化序列，所以它们可以被认为是“通用”序列；即，这些捕获区域和捕获探针可结合许多不同的测定进行使用，唯一不同的是靶序列与捕获区域缔合。在一个实施方案中，本专利技术的阵列包含全部具有基本上相同的序列的捕获探针。在另一个实施方案中，所用阵列包含两个至几个不同部件，其带有具有基本上相同的序列的捕获探针。这些阵列与本领域已知的通过与单独部件的互补性来鉴定单独序列的阵列形成对比，所述单独部件的每个部件包含不同于其他部件的核酸序列的阵列。使用阵列上的单独部件中的单个或有限数量的互补捕获探针序列可以简化产生该阵列所需的生物化学过程并且减少例如由连接产物上的捕获区域和捕获探针之间的结合亲和力差异所引起的检测频率上的潜在伪差。在具体实施方案中，所述阵列包含用于检测来自两个或更多个不同靶基因组区域的单独连接产物、来自单个靶基因组区域的两个或更多个不同基因座或来自选定基因座的两个或更多个不同等位基因的两个或更多个不同捕获探针。即，不同序列的捕获探针与连接产物上对应于不同靶基因组区域的捕获区域、来自单个靶基因组区域的不同基因座或来自选定基因座的不同等位基因杂交。连接产物上的捕获区域与指示靶基因组区域或选定基因座，或指示作为连接产物来源的多态性等位基因的标记缔合。因此，本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于提供胎儿拷贝数变异的统计可能性的测定方法，其包括：提供包含母体和胎儿细胞游离DNA的母体样品；使用至少两个固定序列寡核苷酸来从第一靶基因组区域探查至少48个非多态性基因座，所述至少两个固定序列寡核苷酸包含与所述第一靶基因组区域内的基因座互补的区域，其中所述固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第一标记结合区域和两个限制位点；使用至少两个固定序列寡核苷酸来从第二靶基因组区域探查至少48个非多态性基因座，所述至少两个固定序列寡核苷酸包含与所述第二靶基因组区域内的基因座互补的区域，其中所述固定序列寡核苷酸中的一个包含所述第一捕获区域、第二标记结合区域和两个限制位点；连接所述固定序列寡核苷酸；扩增所述连接的固定序列寡核苷酸以产生扩增子；裂解所述扩增子以产生裂解的扩增子；经由所述裂解的扩增子的所述第一捕获区域和包含与所述第一捕获区域互补的捕获探针的阵列的杂交来检测来自所述第一靶基因组区域和所述第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子，其中来自所述第一基因组靶区域和所述第二基因组靶区域的所述裂解的扩增子和与所述第一捕获区域互补的所述捕获探针竞争性杂交；通过检测所述第一标记结合区域和所述第二标记结合区域来量化所述裂解的扩增子的所述捕获区域，从而确定来自所述第一基因组靶区域和所述第二基因组靶区域的所述探查的非多态性基因座的相对频率；基于所述第一标记结合区域和所述第二标记结合区域的所述相对频率来估计所述第一靶基因组区域和所述第二靶基因组区域的相对频率；对于每个多态性基因座使用至少三个固定序列等位基因特异性寡核苷酸来从不同于所述第一靶基因组区域和所述第二靶基因组区域的至少一个靶基因组区域探查至少48个多态性基因座，其中所述至少三个等位基因特异性寡核苷酸中的两个包含与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、对每个多态性基因座有特异性的捕获区域、针对所述多态性基因座处的每个等位基因的不同标记结合区域和两个限制位点；连接对所述多态性基因座有特异性的所述固定序列寡核苷酸；扩增对所述多态性基因座有特异性的所述连接的固定序列寡核苷酸以产生扩增子；裂解对所述多态性基因座有特异性的所述扩增子以产生裂解的扩增子；经由所述裂解的扩增子的所述捕获区域与所述阵列上的捕获区域的竞争性杂交来检测来自所述多态性基因座的裂解的扩增子；通过检测针对所述裂解的扩增子上的每个等位基因的所述不同标记结合区域来量化所述多态性基因座的所述等位基因，从而确定所述样品中的胎儿DNA分数；由所述量化的等位基因确定所述胎儿DNA分数；以及使用所述样品中所述第一基因组区域和所述第二基因组区域的所述估计的相对频率和所述胎儿DNA分数来计算所述母体样品中胎儿拷贝数变异的统计可能性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.01 US 14/450,144;2014.08.06 US 14/453,3961.一种用于提供胎儿拷贝数变异的统计可能性的测定方法，其包括：提供包含母体和胎儿细胞游离DNA的母体样品；使用至少两个固定序列寡核苷酸来从第一靶基因组区域探查至少48个非多态性基因座，所述至少两个固定序列寡核苷酸包含与所述第一靶基因组区域内的基因座互补的区域，其中所述固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第一标记结合区域和两个限制位点；使用至少两个固定序列寡核苷酸来从第二靶基因组区域探查至少48个非多态性基因座，所述至少两个固定序列寡核苷酸包含与所述第二靶基因组区域内的基因座互补的区域，其中所述固定序列寡核苷酸中的一个包含所述第一捕获区域、第二标记结合区域和两个限制位点；连接所述固定序列寡核苷酸；扩增所述连接的固定序列寡核苷酸以产生扩增子；裂解所述扩增子以产生裂解的扩增子；经由所述裂解的扩增子的所述第一捕获区域和包含与所述第一捕获区域互补的捕获探针的阵列的杂交来检测来自所述第一靶基因组区域和所述第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子，其中来自所述第一基因组靶区域和所述第二基因组靶区域的所述裂解的扩增子和与所述第一捕获区域互补的所述捕获探针竞争性杂交；通过检测所述第一标记结合区域和所述第二标记结合区域来量化所述裂解的扩增子的所述捕获区域，从而确定来自所述第一基因组靶区域和所述第二基因组靶区域的所述探查的非多态性基因座的相对频率；基于所述第一标记结合区域和所述第二标记结合区域的所述相对频率来估计所述第一靶基因组区域和所述第二靶基因组区域的相对频率；对于每个多态性基因座使用至少三个固定序列等位基因特异性寡核苷酸来从不同于所述第一靶基因组区域和所述第二靶基因组区域的至少一个靶基因组区域探查至少48个多态性基因座，其中所述至少三个等位基因特异性寡核苷酸中的两个包含与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、对每个多态性基因座有特异性的捕获区域、针对所述多态性基因座处的每个等位基因的不同标记结合区域和两个限制位点；连接对所述多态性基因座有特异性的所述固定序列寡核苷酸；扩增对所述多态性基因座有特异性的所述连接的固定序列寡核苷酸以产生扩增子；裂解对所述多态性基因座有特异性的所述扩增子以产生裂解的扩增子；经由所述裂解的扩增子的所述捕获区域与所述阵列上的捕获区域的竞争性杂交来检测来自所述多态性基因座的裂解的扩增子；通过检测针对所述裂解的扩增子上的每个等位基因的所述不同标记结合区域来量化所述多态性基因座的所述等位基因，从而确定所述样品中的胎儿DNA分数；由所述量化的等位基因确定所述胎儿DNA分数；以及使用所述样品中所述第一基因组区域和所述第二基因组区域的所述估计的相对频率和所述胎儿DNA分数来计算所述母体样品中胎儿拷贝数变异的统计可能性。2.根据权利要求1所述的测定方法，其中使用三种或更多种合成的固定序列寡核苷酸来探查所述第一靶基因组区域和所述第二靶基因组区域内的每个非多态性基因座。3.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述扩增步骤包括使用聚合酶链式反应的通用扩增。4.根据权利要求1所述的测定方法，其还包括：从所述多态性基因座的所述量化等位基因中鉴定低频等位基因，其中所述母体DNA为纯合的并且所述胎儿DNA为杂合的；以及使用来自所述多态性基因座的所述低频等位基因来确定所述胎儿DNA分数。5.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述第一基因组区域为染色体。6.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述第二基因组区域为染色体。7.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述第一基因组区域为亚染色体区域。8.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述第二基因组区域为亚染色体区域。9.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述固定寡核苷酸的所述标记结合区域包含标记。10.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述固定寡核苷酸的所述标记结合区域包含与含有标记的寡核苷酸互补的序列。11.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述多态性基因座为常染色体基因座。12.根据权利要求1所述的测定方法，其中所述探查步骤还包括使用桥接寡核苷酸。13.一种用于确定胎儿非整倍性的可能性的测定方法，其包括以下步骤：提供包含母体和胎儿细胞游离DNA的母体样品；将与所述母体样品中的第一靶基因组区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿诺德·奥利芬特，雅各布·赞恩，卡拉·朱诺，帕特里克·伯加德，斯蒂芬妮·黄，
申请(专利权)人：阿瑞奥萨诊断公司，
类型：发明
国别省市：美国;US