通过测定AST的含量诊断、预后或监测肝脏疾病的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了用于诊断或监测肝脏疾病的试剂盒和方法，包括用于作为生物样品中的生物标记的胞浆天冬氨酸转氨酶(cAST)和线粒体天冬氨酸转氨酶(mAST)的一个或多个标记的检测试剂和用于检测的抗体。与常规的酶活性测定方法相比，根据本申请的方法，通过测定生物样品尤其血液样品中存在的mAST或cAST的量，可以以高灵敏度更准确地测定肝脏疾病的诊断或预后。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景
本公开涉及基于生物标记的免疫检测来诊断肝癌。相关技术的描述肝脏疾病是人类中最常见的病症，存在超过100种已知的形式，其中许多都是致命的。尤其，肝细胞癌(HCC)是全世界癌症相关死亡的第5大原因并且因HCC的死亡率在上升。患有HCC的患者通常在后期之前是无症状的。因此，患者可以大大受益于早期诊断或检测。在临床实践中，目前使用几个参数检查肝的正常功能。其中之一是测定在肝细胞中以高浓度出现的天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。当肝细胞由于各种因素，比如有毒物质、病毒感染、过量饮酒和肥胖受到破坏时，AST从肝细胞中释放进入血液。AST催化将L-天冬氨酸盐和α酮戊二酸盐分别转化为草酰乙酸盐和L-谷氨酸盐的可逆反应，因此用于诊断和监测肝脏疾病，尤其导致肝细胞破坏的疾病。AST以两种不同的同功酶存在于哺乳动物组织中，一种位于胞浆中(cAST)和另一种位于线粒体中(mAST)。虽然已经进行了数种尝试，但是同工酶的测定还没有被广泛地用于肝脏疾病的临床诊断。这是由于吡哆醛-5-磷酸(AST的辅酶)，它对测定产生不利影响，导致不准确的结果。AST与肝脏疾病相关的典型用途是测定cAST和mAST的总酶活性。然而，测定结果或许不能代表组织中存在的AST的精确数量，因为它们被释放到血液中后它们可能会在血流中被降解或修饰。根据之前的研究，肝脏、心脏、骨骼肌、肾脏和大脑是AST的主要来源，但没有公开关于cAST和mAST的各自分布或存在。韩国专利公开号2002-0053113涉及定量测定血清中的酶，比如AST的免疫学方法。然而，没有提及关于cAST和mAST的各自测定，用于用于肝脏疾病的诊断。美国专利号7,981,627涉及监测和诊断肝硬化的方法，包括测定受试者的血液中的AST水平。美国专利公开号2006-0172286涉及诊断肝癌的方法，包括确定受试者的血清或血液中生物标记，比如AST的活性。然而，他们没有公开分别测定与肝脏疾病的诊断相关的AST的胞浆和线粒体同种型。
技术实现思路
本公开涉及cAST和/或mAST用于检测肝脏疾病的用途，因此提供了用于肝脏疾病的诊断、预后或监测而检测生物样品，比如血液中cAST和/或mAST的水平的方法、试剂盒和组合物。在本公开的一个方面中，提供了肝脏疾病的诊断、预后或监测的试剂盒或组合物，所述试剂盒或组合物包括用于检测生物样品中的胞浆天冬氨酸转氨酶(cAST)和线粒体天冬氨酸转氨酶(mAST)的至少一种的水平的试剂。本专利技术的试剂盒或组合物可用于分析生物样品，包括例如全血、血浆或血清中存在的生物标记。在一个实施方式中，使用血清。在本专利技术的方法、组合物或试剂盒中所使用的试剂是用于定量或定性分析的材料。在一个实施方式中，所述试剂包括用于分析的试剂，所述分析包括如蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫扩散测定、免疫层析法、免疫电泳、免疫染色、免疫沉淀反应、补体结合试验、质谱分析或蛋白质微阵列，但不限于此。在其他实施方式中，所述试剂是特异性识别所述cAST或mAST的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、适配体、亲和力多聚体(Avimer(aviditymultimer))受体、模拟肽、受体、配体或辅因子，但不限于此。在其他实施方式中，本公开中所使用的抗体为保藏于韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为KCTC12483BP、KCTC12484BP和KCTC12485BP的单克隆抗体。本专利技术的试剂盒和组合物用于确定生物样品中cAST和mAST的至少一种的存在和/或水平的各种分析中。这样的分析包括但不限于ELISA、免疫层析法或蛋白质微阵列。本专利技术的试剂盒、组合物和方法中可能诊断、监测和/或预后的肝脏疾病，包括肝炎、肝硬化或肝癌，但不限于此。此外还包括尚未确认为肝脏疾病，但怀疑为肝脏疾病的病情和状况。在本公开的其他方面中，提供了基于有需要的样品或受试者中cAST和/或mAST的水平和/或存在来诊断、预后或监测肝脏疾病的方法。在一个实施方式中，本专利技术的方法包括下述步骤：测定来自有需要的受试者的生物样品中的cAST和mAST的至少一种的水平；比较上述步骤的水平与对照样品的水平或预定的截止值；以及当有变化，尤其与对照的水平相比水平增加时，确定样品或受试者具有肝脏疾病。本专利技术的方法中可以使用的分析为如上所述的，包括例如蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫扩散测定、免疫层析法、免疫电泳、免疫染色、免疫沉淀反应、补体结合试验、质谱分析或蛋白质微阵列，但不限于此。可用本专利技术的方法诊断的肝脏疾病和本专利技术的方法可以使用的生物样品为如上文中所公开的。在本公开的其他方面中，提供了定量分析或检测cAST和/或mAST的至少一种的水平的方法。在一个实施方式中，该方法包括下述步骤：提供对cAST和mAST的至少一种具有特异性的抗体；孵育抗体与来自受试者的血液；以及确定cAST和mAST的至少一种的浓度。可通过如上文所述的现有技术中已知的各种方法，包括例如使用夹心ELISA定量测定cAST和mAST的水平。在本专利技术的试剂盒、组合物和方法中，可以使用的抗体是单克隆抗体。例如，抗cAST抗体是如表1中HCC1-10所公开的至少一种，和抗mAST抗体是如表1中HCM1-10所公开的至少一种。在一个实施方式中，对cAST具有特异性的抗体是表1中的HCC4或HCC5，和对mAST具有特异性的抗体是表1中的HCM4或HCM8。在其他实施方式中，所述抗体为保藏于韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为KCTC12483BP、KCTC12484BP或KCTC12485BP的单克隆抗体。在其他方面中，提供了于2013年09月04日保藏于韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为KCTC12483BP或KCTC12484BP，特异性识别cAST的单克隆抗体。此外还提供了于2013年09月04日保藏于韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为KCTC12485BP，特异性识别mAST的单克隆抗体。本公开的抗体分别以高特异性识别它们各自的抗原cAST和mAST，并且与其他抗原无交叉反应。因此本专利技术的单克隆抗体可有利地用于检测生物样品中cAST和mAST的存在和/或水平。有益效果通过免疫测定cAST和mAST的浓度来诊断或检测慢性肝炎(CH)、肝硬化(LC)和/或HCC的本专利技术的方法与测定酶活性的常规方法相比显示出更高的特异性。因此，本专利技术的方法可有利地用于肝脏疾病的诊断、预后或监测。另外，本专利技术的方法也显示出cAST和mAST的检测范围是0-400μg/l的高灵敏度。因此，与基于生化分析的常规方法相比，本专利技术方法可有利地用于检测血清中甚至少量的cAST和/或mAST。本专利技术的针对cAST或mAST的抗体它们之间没有交叉反应，并且因此可有效地用于准确的区分以及因此可有效地用于准确和分别测定cAST和mAST。与测定AST的总量的常规方法相比，本专利技术的方法通过分别测定cAST和mAST可以更有效地用于诊断肝脏疾病。附图说明结合附图，从实施方式的以下描述，本专利技术的这些方面和/或其他方面以及优点变得显而易见且更容易理解，其中：图1是本专利技术所制备的纯化的重组cAST和mAST的12％的SDS-PAGE(A和C)和蛋白质印迹分析(B和D)的结果，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诊断、预后或监测肝脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测生物样品中的胞浆天冬氨酸转氨酶(cAST)和线粒体天冬氨酸转氨酶(mAST)的至少一种的试剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.13 KR 10-2013-01102531.一种诊断、预后或监测肝脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测生物样品中的胞浆天冬氨酸转氨酶(cAST)和线粒体天冬氨酸转氨酶(mAST)的至少一种的试剂。2.权利要求1所述的试剂盒，其中所述生物样品是全血、血浆或血清。3.权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂以定量或定性水平测定所述cAST和mAST。4.权利要求3所述的试剂盒，其中所述试剂用于选自由下述组成的组中的分析：蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫扩散测定、免疫层析法、免疫电泳、免疫染色、免疫沉淀反应、补体结合试验、质谱分析或蛋白质微阵列。5.权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂是特异性识别所述cAST或mAST的单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、适配体、亲和力多聚体受体、模拟肽、受体、配体或辅因子。6.权利要求5所述的试剂盒，其中所述抗体为保藏于韩国典型培养物保藏中心，保藏编号为KCTC12483BP、KCTC12484BP和KCTC12485BP的单克隆抗体。7.权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒配制成ELISA试剂盒、免疫层析试剂盒或微阵列试剂盒。8.权利要求1所述的试剂盒，其中所述肝脏疾病是肝炎、肝硬化或肝癌。9.在有需要的样品或受试者中诊断肝脏疾病的方法，所述方法包括下述步骤：检测生物样品中cAST和mAST的至少一种的水平；比较所述水平与对照样品的水平；以及当与所述对照的水平相比所述水平增加时，确定所述样品或所述受试者患有肝脏疾病。10.权利要求9所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪涛，朴相烈，金贤贞，李元熙，
申请(专利权)人：韩国帕克特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR