本发明专利技术公开了一种治疗乳腺癌的CAR‑T细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：S1，抽取患者自身的血液，分离出T细胞，选取1‑3mm3的T细胞，放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在36‑38℃消化2‑4小时；S2，向S1中离心管加入D‑Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞2‑6次，离心力200‑400g，持续6‑8min，获得混合液；S3，将混合液放在培养皿中，并将培养皿放入培养箱内，培养箱内的温度为36‑38℃，含有5‑7％的CO2，扩增培养；S4，将慢病毒对S3中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR‑T细胞；S5，将S4中制备的CAR‑T细胞与人血白蛋白以1：1‑2的比例混匀。本发明专利技术成分明确，制作简便，有效降低乳腺癌患者的复发和提高治疗效果，为CAR‑T细胞的临床推广应用提供了更便捷的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法。
技术介绍
在肿瘤免疫治疗方法中，过继性免疫效应细胞治疗因具有众多的优点而受到人们的重视。嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)作为过继免疫细胞治疗的新领域更是成为研究热点。癌症病人因放、化疗导致的免疫系统功能低下，是导致病情复发的重要原因，也是困扰医学界的一大难题。CAR-T细胞疗法则是一种全新的生物免疫治疗方法，通过提取患者体内T淋巴细胞，经过体外10至14天的培养改造，通过载体整合进入到正常T细胞基因序列，形成嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。被重新编码的T细胞就能获得特异性识别和攻击杀伤肿瘤细胞的能力，能精确杀伤肿瘤细胞，但又不会伤及正常细胞。由于是诱导、激活自体细胞，因此该疗法没有通常放、化疗的毒副反应，也没有传统治疗中出现的耐药性。CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区和T细胞信号传导区连接而成，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能以主要组织相容性复合体以非限制性方式使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。CAR的结构分为：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。胞外抗原结合区：通常由针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体的轻链及重链连接而成。铰链区：对于远离细胞膜的抗原表位，无铰链区的CAR-T细胞可以识别和结合抗原；而对于膜近端的抗原表位，一个灵活的铰链区对抗原的识别是必要的。因此针对不同肿瘤相关抗原需要调整铰链区长度，以更好发挥靶向结合能力。跨膜区：来自CD3、CD28、CD8的跨膜区常用来构建CAR，并在CAR的二聚化和T细胞活化中发挥重要作用。胞内信号区：由共刺激分子如CD28、CD134和CD137组成，其中CD28可募集PI3K、Grb2等分子来调节关键转录因子的活性；CD134能促进T细胞体外增殖且增加白介素-2的分泌；CD137是肿瘤坏死因子家族受体，能激活下游的JNK，p38，MAPK和NF-κB信号途径。大多数研究者把CD28或CD137的协同共刺激信号分子融合到CD3结构域的上游。根据胞内信号传导区域的组成不同可分为3代CAR-T细胞。第1代CAR-T细胞的胞内部分仅含CD3ζ结构域，虽然能诱导T细胞的激活和最初的细胞毒性反应，但是存活时间短且只有很低或者没有白介素-2的产生；第2代CAR-T细胞将共刺激分子如CD28、CD137的胞内部分融合到CD3结构域的上游，效果比第1代明显增强因而应用最广泛；第3代CAR-T细胞则同时融合2种共刺激分子到CD3结构域的上游，其抗肿瘤活性与第2代CAR-T细胞相比尚无定论。CAR-T细胞在血液肿瘤的免疫治疗中起到了重要作用，以CD19-CAR-T细胞治疗淋巴细胞肿瘤最为突出，有些已经进入Ⅱ期临床试验。CAR-T细胞在实体肿瘤中的研究大部分仍处于动物实验阶段，但有一些小样本的临床试验和病例报道取得了不错的疗效。乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，随着我国人口城市化的加速，乳腺癌发生率及病死率有逐年上升的趋势。乳腺癌的常规治疗方法主要有：手术治疗、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗。近年来综合治疗提高了乳腺癌的治疗效果，但仍有相当一部分患者复发或对常规治疗耐药，为此我们提出了一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法。本专利技术提出的一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：S1，抽取患者自身的血液，分离出T细胞，选取1-3mm3的T细胞，放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在36-38℃消化2-4小时；S2，向S1中离心管加入D-Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞2-6次，离心力200-400g，持续6-8min，获得混合液；S3，将混合液放在培养皿中，并将培养皿放入培养箱内，培养箱内的温度为36-38℃，含有5-7％的CO2，扩增培养；S4，将慢病毒对S3中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；S5，将S4中制备的CAR-T细胞与人血白蛋白以1：1-2的比例混匀，并加入生理盐水，制成可以治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂。优选地，所述S1，抽取患者自身的血液，选取2mm3的血液放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在37℃消化3小时，每15分钟温和震荡一次。优选地，所述S2中，向S1中离心管加入D-Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞4次，离心力300g，持续7min，获得混合液。优选地，所述S3中，所述培养箱为94-96％饱和湿度。优选地，所述CAR-T细胞的靶细胞抗原为CA153-HER2。优选地，所述慢病毒采用载体包装的方式构建。优选地，所述S2中离心速率为1500r/min。优选地，所述S3中，扩增培养的天数为10-15天。本专利技术先抽取患者自身的血液，分离出T细胞并放入离心管中，加入胶原酶浸润消化，再加入D-Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞，然后离心并放在培养箱内的培养皿中进行扩增培养，再将慢病毒对T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；最后将制备的CAR-T细胞与人血白蛋白以1：1-2的比例混匀，并加入生理盐水，制成可以治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂。本专利技术成分明确，制作简便，有效降低乳腺癌患者的复发和提高治疗效果，为CAR-T细胞的临床推广应用提供了更便捷的方法。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。实施例一本专利技术提出的一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：S1，抽取患者自身的血液，分离出T细胞，选取1mm3的T细胞，放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在36℃消化2小时；S2，向S1中离心管加入D-Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞2次，离心力200g，持续6min，获得混合液；S3，将混合液放在培养皿中，并将培养皿放入培养箱内，培养箱内的温度为36℃，含有5％的CO2，扩增培养；S4，将慢病毒对S3中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；S5，将S4中制备的CAR-T细胞与人血白蛋白以1：1的比例混匀，并加入生理盐水，制成可以治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂。实施例二本专利技术提出的一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：S1，抽取患者自身的血液，分离出T细胞，选取1mm3的T细胞，放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在36.5℃消化2.5小时；S2，向S1中离心管加入D-Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞3次，离心力250g，持续6.5min，获得混合液；S3，将混合液放在培养皿中，并将培养皿放入培养箱内，培养箱内的温度为36.5℃，含有5.5％的CO2，扩增培养；S4，将慢病毒对S3中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；S5，将S4中制备的CAR-T细胞与人血白蛋白以1：1.2的比例混匀，并加入生理盐水，制成可以治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂。实施例三本专利技术提出的一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：S1，抽取患者自身的血液，分离出T细胞，选取2mm3的T细胞，放入离心管中，加入1mg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种治疗乳腺癌的CAR‑T细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，抽取患者自身的血液，分离出T细胞，选取1‑3mm3的T细胞，放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在36‑38℃消化2‑4小时；S2，向S1中离心管加入D‑Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞2‑6次，离心力200‑400g，持续6‑8min，获得混合液；S3，将混合液放在培养皿中，并将培养皿放入培养箱内，培养箱内的温度为36‑38℃，含有5‑7％的CO2，扩增培养；S4，将慢病毒对S3中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR‑T细胞；S5，将S4中制备的CAR‑T细胞与人血白蛋白以1：1‑2的比例混匀，并加入生理盐水，制成可以治疗乳腺癌的CAR‑T细胞制剂。
【技术特征摘要】
1.一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，抽取患者自身的血液，分离出T细胞，选取1-3mm3的T细胞，放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在36-38℃消化2-4小时；S2，向S1中离心管加入D-Hank’s平衡盐溶液冲洗细胞2-6次，离心力200-400g，持续6-8min，获得混合液；S3，将混合液放在培养皿中，并将培养皿放入培养箱内，培养箱内的温度为36-38℃，含有5-7％的CO2，扩增培养；S4，将慢病毒对S3中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；S5，将S4中制备的CAR-T细胞与人血白蛋白以1：1-2的比例混匀，并加入生理盐水，制成可以治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂。2.根据权利要求1所述的一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述S1，抽取患者自身的血液，选取2mm3的血液放入离心管中，加入1mg/ml的胶原酶浸润，在37℃消化3小...
【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，胡广，顾潮江，柳浥时，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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