斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液、冻存液及体外培养、冻存方法技术

斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液、冻存液及体外培养、冻存方法，它涉及一种鱼类精原干细胞的体外培养液、冻存液及体外培养、冻存方法。本发明专利技术解决了现有SSCs体外培养时间相对较短，且SSCs培养基配方成分复杂的问题。体外培养液以L‑15培养基为基础加入HEPES、青霉素、链霉素、NaHCO3、L‑谷氨酸、胎牛血清、鲶鱼血清、bFGF制成。体外培养方法：一、斑点叉尾鮰精巢细胞分离和SSCs的富集；二、SSCs的培养。本发明专利技术斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液和冻存液配方成分简单，易于获得和配制，价格低廉；且能够实现斑点叉尾鮰精原干细胞的长期体外培养和冻存。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鱼类精原干细胞的体外培养液、冻存液及体外培养、冻存方法。
技术介绍
鱼类精原干细胞(spermatogonialstemcells,SSCs)是一类存在于雄鱼性腺中的可以自我更新并能够分化为精子的生殖干细胞。鱼类SSCs的体外培养对于研究动物生殖干细胞发生、发育、分化及调控机制有重要意义。SSCs体外培养技术结合SSCs异体移植技术，可以用于缩短重要经济鱼种的生殖周期、拯救濒临灭绝的鱼类品种；体外培养的SSCs还可以用于鱼类病毒学和毒理学研究。SSCs的体外分离和培养在小鼠、大鼠、人、猪等哺乳动物中报道比较多，鱼类SSCs的研究比较少。目前已报道的SSCs体外培养中培养时间最长的纪录是由Panda等(2011)创造的，其体外培养南亚野鲮SSCs可长达两个月。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有SSCs体外培养时间相对较短，且SSCs培养基配方成分复杂的问题，而提供的一种斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液、冻存液及体外培养、冻存方法。本专利技术斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液以L-15培养基为基础并按每毫升加入25μmol4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、100unit青霉素、100μg链霉素、1.0μgNaHCO3、0.3μgL-谷氨酸、0.2mL胎牛血清(FBS)、0.05mL鲶鱼血清、1ng成纤维细胞生长因子(bFGF)的比例制成，pH值为7.2～7.4。斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养方法按以下步骤进行：一、斑点叉尾鮰精巢细胞分离和SSCs的富集；二、SSCs的培养：将步骤一富集的SSCs接种到铺有明胶的细胞培养板，置于大气环境下、饱和湿度、恒温为26℃的培养箱中培养；其中，SSCs的培养选用上述斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液。上述斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液按体积比加入5％的DMSO制成斑点叉尾鮰精原干细胞的冻存液。斑点叉尾鮰精原干细胞的体外冻存方法按以下步骤进行：一、将斑点叉尾鮰SSCs或扩增培养的斑点叉尾鮰SSCs用胰蛋白酶消化1min，终止消化移至离心管，500g、离心10min，弃上清液；然后加入上述的冻存液，吹打使斑点叉尾鮰SSCs充分悬浮后转入冻存管；二、将冻存管放入细胞冻存盒，细胞冻存盒程序自动降温、降温速率为-1℃/min，将冻存盒置于-80℃低温冰箱中存放24h后再将冻存管转移到液氮中保存，即完成斑点叉尾鮰精原干细胞的体外冻存。本专利技术斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养方法可实现斑点叉尾鮰SSCs的长期稳定体外培养，在保证精原干细胞增殖能力和未分化的前提下至少能培养3个月。本专利技术为SSCs后期异体移植以及SSCs分化机制研究奠定了重要的基础。本专利技术斑点叉尾鮰SSCs的体外培养方法利用SSCs的大量繁殖，为SSCs异体移植提供供体材料，避免了供体鱼被过多的宰杀。本专利技术建立了体外培养SSCs的冻存方法，可用于保存濒临灭绝的鱼类物种遗传资料。本专利技术斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液和冻存液配方成分简单，易于获得和配制，价格低廉；且能够实现斑点叉尾鮰SSCs的长期体外培养和冻存。附图说明图1是采用本专利技术方法培养92天的斑点叉尾鮰SSCs相差显微镜观察图。图2为Plzf、Thy1和Integrin6基因在本专利技术方法培养57d和92d的斑点叉尾鮰精原干细胞以及精子中的相对表达量柱形图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液以L-15培养基为基础并按每毫升加入25μmol4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、100unit青霉素、100μg链霉素、1.0μgNaHCO3、0.3μgL-谷氨酸、0.2mL胎牛血清(FBS)、0.05mL鲶鱼血清、1ng成纤维细胞生长因子(bFGF)的比例制成，pH值为7.2～7.4。本实施方式用1mol/L的HCl溶液或1mol/L的NaOH溶液调节pH值。本实施方式配置好的斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装，4℃保存。具体实施方式二：本实施方式斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养方法按以下步骤进行：一、斑点叉尾鮰精巢细胞分离和SSCs的富集；二、SSCs的培养：将步骤一富集的SSCs接种到铺有明胶的细胞培养板，置于大气环境下、饱和湿度、恒温为26℃的培养箱中培养；其中，SSCs的培养选用具体实施方式一所述斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液。本实施方式步骤一斑点叉尾鮰精巢细胞分离和SSCs的富集可按以下步骤进行：未达到性成熟的二龄斑点叉尾鮰(全长25～30cm)用MD-222麻醉后置于冰上并带回实验室。每条鱼体表用70％酒精消毒后，剪开腹部，无菌摘取双侧精巢，放入装有10mL双抗溶液(含100unit/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1.0μg/mLNaHCO3的Hanks′盐溶液)的15mL无菌离心管中。待全部实验用鱼解剖完毕后，离心管管外壁用酒精消毒后移入超净工作台。在超净工作台中将每个离心管中精巢组织分别到入一个培养皿中，用解剖刀将精巢上粘连的其他组织尽量分离干净。然后用1mL双抗溶液冲洗3次，随后浸泡入5mL0.5％漂白水中2min，取出后立刻用Hanks′盐溶液冲洗3次。将精巢组织剪碎至1mm3的小块，移入含有磁子的无菌三角瓶中，随后加入15mL0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液。在冰上孵育30min后，22℃磁力搅拌下消化1h。消化结束后加入与消化液等量或稍多于消化液的斑点叉尾鮰SSCs的体外培养液终止消化；再用40μm孔径的尼龙滤网过滤后500g、离心10min。弃上清液，加入2mL斑点叉尾鮰SSCs的体外培养液，用移液器把沉淀在离心管底部的细胞轻轻吹散，制成细胞悬液。将细胞悬液轻轻加到Percoll密度梯度液(70％、45％、35％Percoll各2ml从下往上置于15ml离心管)上，4℃、800g、离心40min。梯度离心结束后由于细胞大小及密度差异出现4层细胞，SSCs主要存在最上层。将最上层细胞吸出后加入两倍体积的Hanks′盐溶液，500g、离心10min。弃上清液，加入2mL斑点叉尾鮰SSCs的体外培养液，轻轻吹散沉淀在离心管底部的细胞，制成斑点叉尾鮰SSCs悬液；既实现斑点叉尾鮰精原干细胞的富集。取少量斑点叉尾鮰SSCs悬液，用0.4％的台盼蓝染色(细胞悬液:台盼蓝＝9∶1)，血细胞计数板计算总细胞数、活细胞数、死细胞数及活细胞率。本实施方式斑点叉尾鮰SSCs活细胞率为85.1％。实验：采用本实施方式方法对斑点叉尾鮰SSCs进行传代培养，取第6代培养(培养时间为57d)和第11代培养(培养时间为92d)的斑点叉尾鮰SSCs进行鉴定。(1)细胞观察：在400×相差显微镜下观察细胞第6代培养(培养时间为57d)和第11代培养(培养时间为92d)的斑点叉尾鮰SSCs，并同时观察刚刚富集获得的SSCs。观察结果：刚刚富集获得的SSCs细胞较大、呈圆形。采用本实施方式方法培养57d与92d的细胞仍全部保持SSCs的大小和形状、无差异，细胞核中含有“nuage”或生殖质颗粒(培养时间为92d的斑点叉尾鮰SSCs如图1所示)。(2)分子检测：通过荧光定量方法检测Plzf、Thy本文档来自技高网...

【技术保护点】
斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液，其特征在于斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液以L‑15培养基为基础并按每毫升加入25μmol 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、100unit青霉素、100μg链霉素、1.0μg NaHCO3、0.3μg L‑谷氨酸、0.2mL胎牛血清、0.05mL鲶鱼血清、1ng成纤维细胞生长因子的比例制成，pH值为7.2～7.4。

【技术特征摘要】
1.斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液，其特征在于斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液以L-15培养基为基础并按每毫升加入25μmol4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100unit青霉素、100μg链霉素、1.0μgNaHCO3、0.3μgL-谷氨酸、0.2mL胎牛血清、0.05mL鲶鱼血清、1ng成纤维细胞生长因子的比例制成，pH值为7.2～7.4。2.斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养方法，其特征在于该体外培养方法按以下步骤进行：一、斑点叉尾鮰精巢细胞分离和SSCs的富集；二、SSCs的培养：将步骤一富集的SSCs接种到铺有明胶的细胞培养板，置于大气环境下、饱和湿度、恒温为26℃的培养箱中培养；其中，SSCs的培养选用权利要求1所述斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养液。3.根据权利要求2所述的斑点叉尾鮰精原干细胞的体外培养方法，其特征在于步骤二中按8×106～10×106/mL的密度将步骤一富集的SSCs接种到铺有0.1％明...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚梅，苏宝锋，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23