苏氨酸衰减子的突变体及其应用以及解除苏氨酸操纵子反馈阻遏的方法技术

本发明专利技术公开了一种解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1为310以上336以下的自然数；所述元件乙为编码苏氨酸操纵子的基因。本发明专利技术还保护一种特异DNA分子，自上游至下游依次包括启动子和解除阻遏的苏氨酸操纵子基因。本发明专利技术还保护含有所述特异DNA分子的重组菌以及所述重组菌在生产苏氨酸中的应用。本发明专利技术在实践上可用于细菌发酵生产苏氨酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及苏氨酸衰减子的突变体及其应用以及解除苏氨酸操纵子反馈阻遏的方法。
技术介绍
L-苏氨酸(L-Threonine)的化学名称为α-氨基-β-羟基丁酸，是人体八种必需氨基酸之一。作为生物大分子的基本构成元件，苏氨酸对人和动物的营养及健康具有重要的生理作用，被广泛应用于食品、饲料、以及医药行业，是三大大宗发酵类氨基酸之一。近年来，苏氨酸的市场需求量逐年增长，其中饲料行业对苏氨酸的市场需求量最大。苏氨酸作为安全性饲料添加剂，是继赖氨酸之后的猪生长的第二限制氨基酸，并且是家禽生长的第三限制氨基酸，仅次于赖氨酸和蛋氨酸。微生物发酵法是目前工业化生产苏氨酸的主要方法。大肠杆菌从天冬氨酸合成苏氨酸共需要五步酶催化反应，其中四步反应由苏氨酸操纵子thrABC编码的酶催化。大肠杆菌苏氨酸操纵子的表达由衰减子(Attenuator)进行翻译水平上的转录调控，胞内苏氨酸和异亮氨酸对大肠杆菌苏氨酸操纵子(thrABC)的协同阻遏作用导致其转录弱化。衰减子包含前导肽基因thrL和后续的终止子结构，位于苏氨酸操纵子的启动子之后和thrA基因之前。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种苏氨酸衰减子的突变体及其在苏氨酸发酵生产中的应用。本专利技术首先提供了一种解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1为310以上336以下的自然数；所述元件乙为编码苏氨酸操纵子的基因。n1具体可为311或336。所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”中不含有序列表的序列17第1-293位核苷酸。所述“编码苏氨酸操纵子的基因”为编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的基因、编码高丝氨酸脱氢酶的基因和编码苏氨酸合成酶的基因。所述天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体为ThrA蛋白(野生蛋白)或ThrA*蛋白(突变蛋白)。所述高丝氨酸脱氢酶为ThrB蛋白。所述苏氨酸合成酶为ThrC蛋白。编码ThrA蛋白的基因为thrA基因。编码ThrA*蛋白的基因为thrA*基因。编码ThrB蛋白的基因为thrB基因。编码ThrC蛋白的基因为thrC基因。所述ThrA*蛋白为如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列18所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列18的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体功能的由序列18衍生的蛋白质。所述thrA*基因为如下(a3)或(a4)或(a5)：(a3)编码区如序列表中序列17第337-2799位核苷酸所示的DNA分子；(a4)在严格条件下与(a3)限定的DNA序列杂交且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子；(a5)与(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子。与ThrA蛋白相比，ThrA*蛋白只存在一个氨基酸残基的差异，即第253位氨基酸残基由谷氨酸突变为了组氨酸。所述thrA基因为如下(a6)或(a7)或(a8)：(a6)编码区如序列表中序列14第337-2799位核苷酸所示的DNA分子；(a7)在严格条件下与(a6)限定的DNA序列杂交且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子；(a8)与(a6)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的DNA分子。所述ThrB蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有高丝氨酸脱氢酶功能的由序列19衍生的蛋白质。所述thrB基因为如下(b3)或(b4)或(b5)：(b3)编码区如序列表中序列17第2801-3733位核苷酸所示的DNA分子；(b4)在严格条件下与(b3)限定的DNA序列杂交且编码高丝氨酸脱氢酶的DNA分子；(b5)与(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码高丝氨酸脱氢酶的DNA分子。所述ThrC蛋白为如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列20所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c2)将序列20的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有苏氨酸合成酶功能的由序列20衍生的蛋白质。所述thrC基因为如下(c3)或(c4)或(c5)：(c3)编码区如序列表中序列17第3734-5020位核苷酸所示的DNA分子；(c4)在严格条件下与(c3)限定的DNA序列杂交且编码苏氨酸合成酶的DNA分子；(c5)与(c3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码苏氨酸合成酶的DNA分子。所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)：(d1)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列17第294至336位核苷酸、序列表的序列17第337-2799位核苷酸、序列表的序列17第2801-3733位核苷酸、序列表的序列17第3734-5020位核苷酸；(d2)序列表的序列17第294-5020位核苷酸所示的DNA分子；(d3)序列表的序列17第294-5132位核苷酸所示的DNA分子；(d4)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列14第294至336位核苷酸、序列表的序列14第337-2799位核苷酸、序列表的序列14第2801-3733位核苷酸、序列表的序列14第3734-5020位核苷酸；(d5)序列表的序列14第294-5020位核苷酸所示的DNA分子。本专利技术还保护一种特异DNA分子，自上游至下游依次包括启动子和以上任一所述的“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”。所述启动子具体可为强启动子，例如L启动子、trc启动子、T5启动子、lac启动子、tac启动子或T7启动子。所述启动子具体可为启动子PPL。启动子PPL为如下(e1)或(e2)或(e3)：(e1)序列表中序列13所示的DNA分子；(e2)在严格条件下与(e1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；(e3)与(e1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。所述特异DNA分子具体可为如下(f1)或(f2)：(f1)自上游至下游依次包括如下元件：启动子和所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”；(f2)自上游至下游依次由如下元件组成：启动子、限制性内切酶HindⅢ的酶切识别序列和所述解除阻遏的苏氨酸操纵子基因。本专利技术还保护含有以上任一所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”的重组质粒甲。所述重组质粒甲具体可为在出发质粒的多克隆位点插入所述“解除阻遏的苏氨酸操纵子基因”得到的重组质粒。所述出发质粒为低拷贝、中拷贝或高拷贝数质粒，例如pSC101、pACYC184、pBR322或pTrc99a。所述出发质粒具体可为质粒pACYC184。本专利技术还保护含有以上任一所述特异DNA分子的重组质粒乙。所述重组质粒乙具体可为在出发质粒的多克隆位点插入所述特异DNA分子得到的重组质粒。所述出发质粒为低拷贝、中拷贝或高拷贝数质粒，例如pSC101、pACYC184、pBR322或pTrc99a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1为310以上336以下的自然数；所述元件乙为编码苏氨酸操纵子的基因。

【技术特征摘要】
2016.10.27 CN 20161095836921.一种解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，自上游至下游依次包括元件甲和元件乙；所述元件甲如序列表的序列17第294至n1位核苷酸所示，n1为310以上336以下的自然数；所述元件乙为编码苏氨酸操纵子的基因。2.如权利要求1所述的解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，其特征在于：所述解除阻遏的苏氨酸操纵子基因中不含有序列表的序列17第1-293位核苷酸。3.如序列表的序列1或2所述的解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，其特征在于：所述“编码苏氨酸操纵子的基因”为编码天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶复合体的基因、编码高丝氨酸脱氢酶的基因和编码苏氨酸合成酶的基因。4.如权利要求1所述的解除阻遏的苏氨酸操纵子基因，其特征在于：所述解除阻遏的苏氨酸操纵子基因为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)：(d1)自上游至下游依次包括如下元件的DNA分子：序列表的序列17第294至336位核苷酸、序列表的序列17第337-2799位核苷酸、序列表的序列17第2801-3733位核苷酸、序列表的序列17第3734-5020位核苷酸；(d2)序列表的序列17第294-5020位核苷酸所示的DNA分子；(d...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘树文，温廷益，商秀玲，张芸，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11