本发明专利技术公开了一种外周血淋巴细胞微核的检测试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的试剂盒包括：红细胞溶血素、红色荧光染料溶液、裂解液和阳性标准品；所述裂解液包括氯化钠、柠檬酸钠、Triton X‑114、绿色荧光染料和RNase；并基于所述试剂盒和流式细胞检测的方法提供了一种外周血淋巴细胞微核的检测方法。通过实验证明：本发明专利技术的外周血淋巴细胞微核的检测试剂盒和方法快速、准确，在保证实验结果客观和真实的前提下，不仅降低了检测成本，而且实验还具有可重复性，可广泛应用于临床诊断监测健康人群的职业暴露遗传损伤，肿瘤病人康复检测遗传损伤和细胞遗传科学研究需要。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种外周血淋巴细胞微核的检测试剂盒及其检测方法，特别涉及一种基于流式细胞仪检测外周血淋巴细胞微核的自动体外诊断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
微核(micronucleus)形成的基础理论是正在复制的细胞由于出现染色体断裂或者纺锤装置功能异常而导致有丝分裂染色体分布紊乱，分裂后期这些染色体碎片或整条染色体遗留在细胞液中。目前，微核试验包括普通培养微核检测(MNT)和细胞胞质分裂阻滞微核检测(CBMNT)。微核试验是遗传毒性试验的有效试验检测方法，其检测终点明确、计数简单、结果重复性好，可广泛的应用在不同的细胞类型且易于开展。微核试验为药品、食物添加剂、农药、化妆品等人们日常生活密切接触的化合物的安全性评价提供实验论据。同时在职业暴露人群遗传损害监测、工厂劳动者的职业微环境对健康的影响调查、接受化学疗法的患者的遗传损害调查、生态环境检测等方面广泛应用。常用两栖类和鱼类红细胞微核试验，对水生生态环境污染进行评价及监测，使用紫露草和蚕豆根尖微核试验对空气和水污染进行监测，人外周血淋巴细胞微核试验对放射工作人员进行健康监测等。流式细胞术(flowcytometry，FCM)是20世纪60年代后期发展起来的一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的新技术。检测原理是荧光标记待测细胞并制成单细胞悬液，根据接收激光照射后液流内细胞的散色光信号和荧光信号分析细胞的物理化学特征，如细胞大小、被测细胞内部颗粒的信息等。目前职业人群健康监护开展的微核检测项目是常规培养淋巴细胞微核试验。常规外周血淋巴细胞微核试验，步骤繁琐，包括外周血取样、接种、培养、制片、染色、镜检等步骤，采用人工制片、读片分析，容易受技术员主观因素、专业知识及经验的影响，同时工作量大。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种人外周血淋巴细胞微核的检测方法。本专利技术提供的人外周血淋巴细胞微核的检测方法包括如下步骤：(1)用红色荧光染料对离体的人外周血淋巴细胞进行染色，得到红色荧光染色后细胞；(2)用裂解液对所述红色荧光染色后细胞进行一次裂解和染色，得到裂解和染色后细胞；(3)流式细胞仪检测所述裂解和染色后细胞，根据荧光强度判断活细胞中含有微核的细胞；所述裂解液中的溶质由氯化钠、柠檬酸钠、TritonX-114、Rnase和绿色荧光染料组成。上述方法中，所述离体的人外周血淋巴细胞为用溶血素裂解全血培养物后得到的人外周血淋巴细胞；所述离体的人外周血淋巴细胞具体的获得方法如下：将待测人的外周血样本在淋巴细胞培养液中培养，将所述培养后细胞离心，弃上清液，收集沉淀；向所述沉淀中加入溶血素，裂解沉淀中的红细胞，离心，收集沉淀，即得到人外周血淋巴细胞。上述方法中，所述红色荧光染料为EMA或7-AAD。上述方法中，所述绿色荧光染料为DAPI、SYTOXGreen或YO-PRO-1。上述方法中，所述氯化钠、所述柠檬酸钠、所述TritonX-114、所述Rnase和所述绿色荧光染料的配比为(310-330)mg：(540-560)mg：(0.16-0.17)mg：0.688U：(4.2-4.5)mg。上述方法中，所述红色荧光染料为EMA溶液。上述方法中，所述绿色荧光染料为DAPI。上述方法中，所述氯化钠、所述柠檬酸钠、所述TritonX-114、所述Rnase和所述DAPI的配比为321mg：550mg：0.165mg：0.688U：4.373mg。上述方法中，所述氯化钠在所述裂解液中的浓度为0.293-0.878mg/ml；所述柠檬酸钠在所述裂解液中的浓度为0.588-1.176mg/ml；所述TritonX-114在所述裂解液中的浓度为0.214-0.322μg/ml；所述DAPI在所述裂解液中的浓度为0.2-0.5μg/ml；所述RNase在所述裂解液中的浓度为1.0-1.5μg/ml；所述EMA溶液中EMA的浓度为0.10-0.25mg/ml。上述方法中，所述氯化钠在所述裂解液中的浓度为0.579mg/ml；所述柠檬酸钠在所述裂解液中的浓度为0.991mg/ml；所述TritonX-114在所述裂解液中的浓度为0.297μg/ml；所述DAPI在所述裂解液中的浓度为0.4μg/ml；所述RNase在所述裂解液中的浓度为1.239μg/ml；所述EMA溶液中EMA的浓度为0.125mg/ml。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测人外周血淋巴细胞微核的试剂盒。本专利技术提供的用于检测人外周血淋巴细胞微核的试剂盒，包括上述红色荧光染料、上述裂解液、溶血素和阳性标准品。上述试剂盒中，所述阳性标准品的制备方法如下：取正常健康人外周血1ml，Co601Gy/s的剂量率进行辐照，辐照30s后，用淋巴细胞培养液培养72h，经低渗预固定后，得到辐照后的淋巴细胞，即为阳性标准品。本专利技术的最后一个目的是提供上述方法或上述试剂盒的新用途。本专利技术提供了上述方法或上述试剂盒在检测或辅助检测在人外周血淋巴细胞微核率中的应用。本专利技术还提供了上述方法或上述试剂盒在检测和/或监护人群健康中的应用。本专利技术的流式细胞仪的微核自动化检测能显著提高检测效率和通量，同时保证了分析结果的客观性。具体体现在：1、流式体外微核检测最大的优势是检测速度快，能在短时间内完成多个样本的检测。流式完成一个试验样本仅需要2～3min，检测速度比人工读片快至少40～100倍；且较其他自动化检测方法如计算机图像分析系统、激光扫描细胞仪检测速度更快，能在极短的时间检测大量样品，节省早期化合物遗传毒性初筛的时间及人力。显微镜检测技术和图像分析技术一般检测1000～2000个细胞，而流式细胞仪能检测不少于5000个细胞，故流式适用于弱遗传毒性化合物及低剂量强微核诱导剂的微核检测。2、数据的采集具有客观性。流式细胞仪检测通过设定阈值减少细胞碎片和其他小颗粒性物质的干扰，且操作者可以根据试验的具体情况调整阈值的大小。同时，可设置逻辑门选择分析的对象，排除其他不必要的干扰。3、可减少试验室内或试验室间的差异。检测微核时，在同一实验室和不同的实验室之间采用相同的质控标准，通过调整光电倍增管电压使溶剂对照组细胞G1期核荧光信号出现在同一通道，从而保证试验的平行一致性；也可通过设置明确的荧光信号强度定义微核，保证不同实验室间微核检测区域一致而增加分析结果的客观性。本专利技术针对现有的人淋巴细胞微核检测方法中存在的步骤繁琐，主观性强等问题，提供了一套诊断试剂以及利用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞微核的方法，本专利技术的诊断试剂主要由溶血素、核酸染料、破膜试剂和阳性对照物组成。本专利技术利用溶血素裂解红细胞得到淋巴细胞，更加符合健康人群临床检测的实际需要，与分离淋巴细胞后培养，再检测微核相比，简化了试验步骤，节约了成本，降低了技术难度。本专利技术的人外周血淋巴细胞微核体外诊断试剂只需要一种裂解液和一次裂解，裂解后溶液澄清透亮。且本专利技术的裂解液中的DAPI可以染色活细胞，使得裂解和染色显得容易，提高了灵敏度。通过实验证明：本专利技术的人外周血淋巴细胞微核体外诊断试剂和方法快速、准确，在保证实验结果客观和真实的前提下，不仅降低了检测成本，而且实验还具有可重复性，可广泛应用于临床诊断监测健康人群的职本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人外周血淋巴细胞微核的检测方法，包括如下步骤：(1)用红色荧光染料对离体的人外周血淋巴细胞进行染色，得到红色荧光染色后细胞；(2)用裂解液对所述红色荧光染色后细胞进行一次裂解和染色，得到裂解和染色后细胞；(3)流式细胞仪检测所述裂解和染色后细胞，根据荧光强度判断活细胞中含有微核的细胞；所述裂解液中的溶质由氯化钠、柠檬酸钠、Triton X‑114、Rnase和绿色荧光染料组成。
【技术特征摘要】
1.一种人外周血淋巴细胞微核的检测方法，包括如下步骤：(1)用红色荧光染料对离体的人外周血淋巴细胞进行染色，得到红色荧光染色后细胞；(2)用裂解液对所述红色荧光染色后细胞进行一次裂解和染色，得到裂解和染色后细胞；(3)流式细胞仪检测所述裂解和染色后细胞，根据荧光强度判断活细胞中含有微核的细胞；所述裂解液中的溶质由氯化钠、柠檬酸钠、TritonX-114、Rnase和绿色荧光染料组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离体的人外周血淋巴细胞为用溶血素裂解全血培养物后得到的人外周血淋巴细胞；和/或，所述红色荧光染料为EMA或7-AAD；和/或，所述绿色荧光染料为DAPI、SYTOXGreen或YO-PRO-1；和/或，所述氯化钠、所述柠檬酸钠、所述TritonX-114、所述Rnase和所述绿色荧光染料的配比为(310-330)mg：(540-560)mg：(0.16-0.17)mg：0.688U：(4.2-4.5)mg。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述红色荧光染料为EMA溶液；和/或，所述绿色荧光染料为DAPI；和/或，所述氯化钠、所述柠檬酸钠、所述TritonX-114、所述Rnase和所述DAPI的配比为321mg：550mg：0.165mg：0.688U：4.373mg。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述氯化钠在所述裂解液中的浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨学琴，黄先青，张文，
申请(专利权)人：深圳市职业病防治院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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