一种基于光片照明的免标记细胞检测装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种基于光片照明的免标记细胞检测装置及方法，包括光片发生单元即通过柱面透镜将激光光束整形成微米级厚度的均匀照明光片，光片激发置于由精密位移台控制移动的样本微腔室中的微粒或细胞悬液，单个微粒或细胞的形态显微图像和二维光散射图样通过物镜分别在聚焦和去焦模式下被探测器记录，结果输入至成像分析系统进行图像处理和识别分类。本发明专利技术采用的光片照明方法能够有效限制激发区域，抑制光散射成像中的背景干扰，实现对单个微粒或细胞的有效激发以及在亚微米分辨率水平的微粒尺寸鉴别。光片照明激发二维光散射技术能够避免复杂的染色操作和荧光信号探测过程，对衰老细胞实现免标记检测和分类。本发明专利技术适用性强，具备推广性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于光片照明的免标记细胞检测装置及方法，可实现亚微米的微粒尺寸识别，并可用于衰老细胞与正常细胞的分类，而细胞衰老涉及多种衰老性疾病比如恶性肿瘤以及心血管疾病等。
技术介绍
临床上对细胞的检测分类主要依赖于流式细胞仪。传统流式细胞仪通过利用复杂光路系统将激光光束整形成与细胞体积相近的椭圆光束来限制激发区域，减小干扰，并严格控制鞘流系统，保持激光束与样本流正交，从而达到单个样本信号检测和采集的目的，控制过程复杂，成本高。在对生物细胞的检测与分类方面，传统细胞仪通常需要使用各种荧光试剂或染料对细胞进行复杂的染色标记，染色操作过程繁琐复杂，外力操作会对细胞的结构和功能产生一定的损害，此外，荧光信号较弱，测量光路相对复杂。传统流式细胞仪通过探测颗粒一维光散射信号，即前向光散射强度，可实现对颗粒的尺寸鉴别。这种根据光强度相对大小的尺寸测量方法对激发光源的稳定性，检测器灵敏度以信号转换器的性能提出较高要求。光片照明是一种将光束调制成薄片照明光源的技术。该技术主要应用于荧光显微成像，利用光片仅激发焦平面上的荧光分子的优点来提高成像分辨率，可实现对生物组织、胚胎、神经网络、细胞团等的高分辨率成像。但是，目前光片照明方法的应用主要依赖于荧光标记技术，应用范围存在一定局限性。临床上对衰老细胞的检测主要借助于生物标记技术，即SA-β-Gal染色检测。衰老细胞由于β-半乳糖苷酶的催化呈现深蓝色，从而通过光学显微镜镜检可区别衰老细胞与未衰老细胞，该技术已被广泛应用于生物学衰老研究。另一种方法是通过流式细胞仪技术分选衰老细胞与未衰老细胞。在流式细胞仪检测中，需要在细胞衰老的转录调控区域构建表达绿色荧光蛋白(GFP)的报告基因，从而定量检测未衰老细胞与衰老细胞。流式细胞仪测量方法能够更清楚地区分衰老细胞，但是报告基因的随机插入会出现额外的差异表达，导致报告基因不均一，影响检测效果。总而言之，以上方法易于检测，准确度较高，但过程步骤复杂，且用时较长，成本较高，同时人工阅片主观性较强又耗时耗力，而细胞标记、染色过程也可能会改变细胞结构，影响实验结果。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述问题，提出了一种基于光片照明的免标记细胞检测装置及方法。本专利技术采用光片照明技术作为激发方式均匀激发单个微颗粒或细胞，获得样本的低背景噪声的二维光散射图样，并应用于单个微颗粒的快速尺寸鉴定以及衰老细胞的免标记检测分类。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于光片照明的免标记细胞检测装置，包括将激光光束整形成薄光片的光片发生单元，该薄光片均匀激发由样本控制单元带动的在垂直和水平面上的三维空间移动的待测样本，样本的形态显微图像和二维光散射图像由图像采集单元捕获，交由成像分析单元在提取图像特征参数的基础上实现自动分类；所述光片发生单元，包括激光光源、反射镜片、中性密度片以及柱面透镜，激光光源发射圆柱状光束，经过反射镜控制传播方向以及中性密度片调整光强后，投射到柱面透镜，柱面透镜调制光束宽度产生厚度为几微米到几十微米的照明光片。所述样本控制单元，包括承载样本悬液的样本芯片，用于固定样本芯片的固定器，和带动样本沿x轴，y轴以及z轴移动的电动位移台。所述图像采集单元包括显微物镜和CMOS探测器，图像采集单元具有聚焦模式和去焦模式两种工作模式；在聚焦模式下，物镜对准精确定位后的待测样本聚焦，通过CMOS探测器记录单个样本的形态显微图像；在去焦模式下，物镜在远离待测样本一定距离捕获样本分布于空间的散射光，该距离定义为正向去焦距离，被捕获的散射光投射到CMOS探测器平面，探测器记录该样本的二维光散射图像。所述成像分析单元包括Mie光散射模型模拟模块、特征参数提取模块和支持向量机自动分类模块，所述Mie光散射模型模拟模块，根据Mie光散射理论模型，实现对微粒的二维光散射模拟；所述特征参数提取模块，根据捕获的样本二维光散射图样提取特征参数，包括图样的光强度扫描和傅里叶方法分析；所述支持向量机自动分类模块，将采集的样本结果分为训练集和测试集，根据输入的特征值，通过寻找最优参数，自动优化分类函数，实现样本的自动分类。基于光片照明的免标记细胞检测方法，包括以下步骤：(1)构建样本芯片，选用两片常规玻璃薄片作为样本腔室的上下表面，两片盖玻片作为垫片，分别置于两端，并被夹持在玻璃薄片之间，构成可承载样本液溶液的微腔室。(2)配置样本悬液并通过移液管导入样本微腔室中，将准备好的样本芯片通过自制固定器固定在精密三维电动位移台上；(3)控制电动位移台移动样本，确定待成像样本，使待测样本位于物镜中心，并对样本聚焦，触发CMOS探测器记录该样本的形态显微图像；(4)启动光片发生装置，校准光路，确定激光光束依次通过光片发生单元中反射镜、中性密度片、以及柱面透镜的光轴，保持光束水平传播，水平调整柱面透镜位置，使照明光片的束腰位置处于探测物镜中心；(5)照明光片激发悬液中的待测样本，来自单个颗粒或单个细胞的散射光分布于三维空间，调整显微物镜远离待测样本，使物镜在去焦模式下采集相应角度范围内的散射光，触发CMOS探测器记录该样本的二维光散射图样；(6)将CMOS探测器捕获的二维光散射图样输入至成像分析系统进行图像处理和样本识别及分类。所述步骤(2)中，自制固定器由夹片和固定螺丝组成，可稳定夹持样本芯片，并兼容于光学倒置显微镜。所述步骤(6)中，采用支持向量机算法对实验结果自动分类，对预处理后的实验结果进行分组学习训练和预测，提供分类结果以及分类评估值。一种对亚微米微粒的尺寸识别系统，应用上述基于光片照明的免标记细胞检测装置。一种对衰老细胞与正常细胞的分类系统，应用上述基于光片照明的免标记细胞检测装置。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术采用探测侧向二维光散射图样实现颗粒亚微米水平的尺度差异的灵敏检测，比传统流式细胞仪中根据一维前向光强信号的方法相对稳定；(2)本专利技术采用静态细胞悬液扫描成像方式，摆脱了传统流式细胞仪中复杂的液流控制系统，操作方便，成本相对低廉，具备广泛适用性；(3)在传统镜检时，制备生物样本涂片时往往需要通过干燥、固定以及冷冻等处理，对样本的结构会造成一定的破坏，影响观察效果。本专利技术中，待测样本置于悬液状态下观测与成像，为样本提供了较好的结构与功能保护，并且能够让样本在更接近其原始状态下进行测量，尤其适用于活细胞成像，保证了数据测量的真实性和有效性；(4)本专利技术采用光片照明方式作为激发光源，提供高质量的激发光片限制激发区域，避免了同时激发其他细胞引起干扰，提供较好的成像信噪比，灵活的光片厚度与位置控制易于对细胞进行快速定位和扫描，高效的能量利用率可降低成像所需激发功率，减少光毒性对细胞活性的影响；(5)本专利技术采集装置具备两个工作模式，可以同时捕获单个细胞的形态图像和二维光散射图样，有助于建立细胞结构与光学性质的对应关系，实现对单个细胞行为的成像和分析，弥补了传统流式细胞仪对单个颗粒或细胞分析时仅提供光强信号的不足；(6)本专利技术采用免标记方法对衰老细胞检测，能够实现对衰老与正常细胞的快速自动分类，摆脱了传统方法对细胞染色以及人工阅片的繁琐过程；(7)本专利技术适用于其他生物细胞的成像识别与分类，具备普遍推广性。附图说明图1为本专利技术装置的结构和原理示意图；图2(a)-图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于光片照明的免标记细胞检测装置，其特征是：包括将激光光束整形成薄光片的光片发生单元，该薄光片均匀激发由样本控制单元带动的在垂直和水平面上的三维空间移动的待测样本，样本的形态显微图像和二维光散射图像由图像采集单元捕获，交由成像分析单元在提取图像特征参数的基础上实现自动分类；所述光片发生单元，包括激光光源、反射镜片、中性密度片以及柱面透镜，激光光源发射圆柱状光束，经过反射镜控制传播方向以及中性密度片调整光强后，投射到柱面透镜，柱面透镜调制光束宽度产生照明光片。

【技术特征摘要】
1.一种基于光片照明的免标记细胞检测装置，其特征是：包括将激光光束整形成薄光片的光片发生单元，该薄光片均匀激发由样本控制单元带动的在垂直和水平面上的三维空间移动的待测样本，样本的形态显微图像和二维光散射图像由图像采集单元捕获，交由成像分析单元在提取图像特征参数的基础上实现自动分类；所述光片发生单元，包括激光光源、反射镜片、中性密度片以及柱面透镜，激光光源发射圆柱状光束，经过反射镜控制传播方向以及中性密度片调整光强后，投射到柱面透镜，柱面透镜调制光束宽度产生照明光片。2.如权利要求1所述的一种基于光片照明的免标记细胞检测装置，其特征是：所述成像分析单元包括Mie光散射模型模拟模块、特征参数提取模块和支持向量机自动分类模块；所述Mie光散射模型模拟模块，根据Mie光散射理论模型，实现对微粒的二维光散射模拟；所述特征参数提取模块，根据捕获的样本二维光散射图样提取特征参数，包括图样的光强度扫描和傅里叶方法分析；所述支持向量机自动分类模块，将采集的样本结果分为训练集和测试集，根据输入的特征值，通过寻找最优参数，自动优化分类函数，实现样本的自动分类。3.如权利要求1所述的一种基于光片照明的免标记细胞检测装置，其特征是：所述样本控制单元，包括承载样本悬液的样本芯片，用于固定样本芯片的固定器，和带动样本沿x轴，y轴以及z轴移动的电动位移台。4.如权利要求1所述的一种基于光片照明的免标记细胞检测装置，其特征是：所述图像采集单元包括显微物镜和CMOS探测器，图像采集单元具有聚焦模式和去焦模式两种工作模式，在聚焦模式下，物镜对准精确定位后的待测样本聚焦，通过CMOS探测器记录单个样本的形态显微图像，在去焦模式下，物镜在远离待测样本一定距离捕获样本分布于空间的散射光，该距离定义为正向去焦距离，被捕获的散射光投射到CMOS探测器平面，探测器记录...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏绚涛，林梅爱，刘巧，谯旭，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37