一种人体外周血淋巴细胞培养基及其制备方法技术

本发明专利技术属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种人体外周血淋巴细胞培养基及其制备方法。本发明专利技术培养基主要包含以下成分：RPMI1640培养基，小牛血清，胶原蛋白，透明质酸钠，胰高血糖素，促甲状腺释放激素，白芍总苷，亚油酸，丁二胺，水合葡糖酸铁盐，谷胱甘肽，多聚赖氨酸。本发明专利技术培养基能够有效抑制微生物和病毒，试剂稳定性好，培养淋巴细胞转化率与淋巴细胞分裂指数高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养基
，具体涉及一种人体外周血淋巴细胞培养基及其制备方法。
技术介绍
人体外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在GI期(GO期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素PHA时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂，这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得部分有丝分裂细胞。这种方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒性学等方面广泛应用。目前，影响人体外周血淋巴细胞生长的原因有：(1)病毒或微生物感染：当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件；(2)培养温度不恒定：维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度，如果温度有偏离，细胞的正常代谢会受到影响，甚至导致细胞死亡。(3)营养物质缺乏：充足的营养物质时细胞正常代谢生长的最重要前提，如在细胞长期培养过程中，一些营养物质会被细胞代谢消耗，若供应不足会导致细胞生长减慢，影响细胞各项功能，甚至会导致细胞凋亡，因此，在细胞培养过程中需要及时补加营养物质来满足细胞生长所需。(4)气体环境：氧气和二氧化碳是维持细胞生存的必要条件之一，氧气的功能是参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需要的各种成分；二氧化碳的主要功能是维持细胞培养体系的pH。(5)pH不稳定：适宜的pH环境是细胞生长的重要前提，而在细胞培养过程中产生的代谢物会影响pH变化，从而影响细胞生长。因此开发一种适宜细胞生长的培养基，是解决上述问题的关键。传统的培养基一般是在合成培养基中添加血清，但血清来源复杂，难以确保质量均一，同时血清中可能含有病毒等对细胞生长有害的因子。并且，在细胞培养过程中，只能通过操作无菌和环境无菌来确保无菌的环境。中国专利(CN101550408B)公开了一种人体外周血淋巴细胞培养基，其包括：RPMI1640液体培养基77-81.9％、牛血清10-14.9％、PHA4-6％、非硫酸化糖胺聚糖2-5％、CPPs2-5％和双抗0.05-0.1％。该培养基具有淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数高，试剂稳定性好的优势。但是在培养基中采用青霉素、链霉素虽然能够有效抑制微生物和病毒的感染，但是在一定程度上也会影响细胞的生长。培养集中添加有牛血清，则会存在血清带来的各种风险。因此，目前仍需要开发一种效果优良的人外周淋巴细胞培养基。
技术实现思路
针对现有细胞培养基存在容易被病毒或微生物感染、营养物质缺乏和pH不稳定等问题，本专利技术提供了一种人体外周血淋巴细胞培养基及其制备方法。本专利技术培养基能够有效抑制微生物和病毒，试剂稳定性好，培养淋巴细胞转化率与淋巴细胞分裂指数高。本专利技术通过以下技术方案实现：一种人体外周血淋巴细胞培养基，主要包含以下成分及其浓度：RPMI1640培养基50-56g/L，小牛血清1-2g/L，胶原蛋白4-5g/L，透明质酸钠3-4.5g/L，胰高血糖素0.1-1.5mg/L，促甲状腺释放激素5-7μg/L，白芍总苷15-30mg/L，亚油酸1-3g/L，丁二胺0.1-0.5g/L，水合葡糖酸铁盐1-5mg/L，谷胱甘肽0.1-5μg/L，多聚赖氨酸0.5-3.5mg/L。优选地，所述人体外周血淋巴细胞培养基由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基55g/L，小牛血清1.5g/L，胶原蛋白4.76g/L，透明质酸钠3.75g/L，胰高血糖素1.43mg/L，促甲状腺释放激素6.8μg/L，白芍总苷22.56mg/L，亚油酸2.75g/L，丁二胺0.32g/L，水合葡糖酸铁盐3.5mg/L，谷胱甘肽4.25μg/L，多聚赖氨酸3.15mg/L。胶原蛋白(也称胶原)是细胞外基质的一种结构蛋白质，呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，具有信号转导、生长因子与细胞因子的运输的功能；同时还具有促进淋巴细胞贴壁的功能。透明质酸钠为白色纤维状或粉末状固体，有很强的吸湿性，溶于水。透明质酸钠可有效地增加细胞培养液中电解质扩散及运转，能够增加细胞通透性，减少有关蛋白质的丢失，改善营养代谢；并且有效稳定pH值，从而使细胞能达到有效生长并增加目的蛋白表达率。白芍总苷在低浓度范围内能够促进淋巴细胞的增殖。亚油酸，丁二胺能提供细胞膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质。水合葡糖酸铁盐(CAS号：22830-45-1)能够有效促进细胞对铁的吸收。多聚赖氨酸(CAS号：25988-63-0)目前天然防腐剂中具有优良防腐性能的微生物类防腐剂。它是由25～30赖氨酸残基聚合而成，具有强烈的抑菌能力，并且是一种促细胞贴壁成分。优选地，所述人体外周血细胞培养基制备方法，分为以下步骤：(1)准确称取RPMI1640培养基干粉后置于消毒容器内，添加超纯水稀释后搅拌混匀，得溶液I；(2)采用巴氏消毒法将牛血清溶解后低温处理后加入溶液I中，得溶液II；(3)将胶原蛋白，透明质酸钠，胰高血糖素，促甲状腺释放激素，白芍总苷，亚油酸，丁二胺，水合葡糖酸铁盐，谷胱甘肽4，多聚赖氨酸加入溶液II，充分混匀后过滤灭菌，即得。本专利技术培养基与现有培养基相比具有以下优点：(1)本专利技术培养基能够有效抑制微生物和病毒，试剂稳定性好。(2)本专利技术培养基培养淋巴细胞转化率与淋巴细胞分裂指数高。具体实施例下面结合实施例对本专利技术做进一步详细说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。白芍总苷，购于陕西森弗生物技术有限公司；胶原蛋白，购于天津滨海捷成专类化工有限公司；小牛血清，购于上海士锋生物科技有限公司。实施例1一种人体外周血淋巴细胞培养基一种人体外周血淋巴细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基55g/L，小牛血清1.5g/L，胶原蛋白4.76g/L，透明质酸钠3.75g/L，胰高血糖素1.43mg/L，促甲状腺释放激素6.8μg/L，白芍总苷22.56mg/L，亚油酸2.75g/L，丁二胺0.32g/L，水合葡糖酸铁盐3.5mg/L，谷胱甘肽4.25μg/L，多聚赖氨酸3.15mg/L。制备方法，分为以下步骤：(1)准确称取RPMI1640培养基干粉后置于消毒容器内，添加超纯水稀释后搅拌混匀，得溶液I；(2)采用巴氏消毒法将牛血清溶解后低温处理后加入溶液I中，得溶液II；(3)将胶原蛋白，透明质酸钠，胰高血糖素，促甲状腺释放激素，白芍总苷，亚油酸，丁二胺，水合葡糖酸铁盐，谷胱甘肽4，多聚赖氨酸加入溶液II，充分混匀后过滤灭菌，即得。实施例2一种人体外周血淋巴细胞培养基一种人体外周血淋巴细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基56g/L，小牛血清2g/L，胶原蛋白5g/L，透明质酸钠4.5g/L，胰高血糖素1.5mg/L，促甲状腺释放激素7μg/L，白芍总苷30mg/L，亚油酸3g/L，丁二胺0.5g/L，水合葡糖酸铁盐5mg/L，谷胱甘肽5μg/L，多聚赖氨酸3.5m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人体外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，主要包含以下成分及其浓度：RPMI1640培养基50‑56g/L，小牛血清1‑2g/L，胶原蛋白4‑5g/L，透明质酸钠3‑4.5g/L，胰高血糖素0.1‑1.5mg/L，促甲状腺释放激素5‑7μg/L，白芍总苷15‑30mg/L，亚油酸1‑3g/L，丁二胺0.1‑0.5g/L，水合葡糖酸铁盐1‑5mg/L，谷胱甘肽0.1‑5μg/L，多聚赖氨酸0.5‑3.5mg/L。

【技术特征摘要】
1.一种人体外周血淋巴细胞培养基，其特征在于，主要包含以下成分及其浓度：RPMI1640培养基50-56g/L，小牛血清1-2g/L，胶原蛋白4-5g/L，透明质酸钠3-4.5g/L，胰高血糖素0.1-1.5mg/L，促甲状腺释放激素5-7μg/L，白芍总苷15-30mg/L，亚油酸1-3g/L，丁二胺0.1-0.5g/L，水合葡糖酸铁盐1-5mg/L，谷胱甘肽0.1-5μg/L，多聚赖氨酸0.5-3.5mg/L。2.根据权利要求1所述人体外周血细胞培养基，其特征在于，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基55g/L，小牛血清1.5g/L，胶原蛋白4.76g/L，透明质酸钠3.75g/L，胰高...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶宗耀，
申请(专利权)人：叶宗耀，
类型：发明
国别省市：广东;44