顺行跨单级突触神经示踪系统技术方案

本发明专利技术提供了顺行跨单级突触(monosynaptic transneuronal)病毒示踪系统,用于绘制在一个特定的脑核团的特殊类型神经元的直接后突触靶标；所述顺行跨单级突触病毒示踪系统包括H129衍生的重组缺陷型HSV‑1病毒，其包含整合的第一表达盒含有第一启动子、第一荧光蛋白编码序列，和抗性肽编码序列，其中第一表达盒代替整个或部分胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因序列，产生的H129衍生的重组缺陷型HSV‑1 H129病毒丧失TK功能(H129‑ΔTK‑tdT)；和AAV9衍生的重组AAV9辅助病毒(AAV9‑TK‑GFP和AAV9‑DIO‑TK‑GFP)，其包含整合的第二表达盒含有第二启动子、TK编码序列，连接子肽编码序列，和第二荧光蛋白编码序列，其中第二表达盒的TK表达使H129衍生的重组缺陷型HSV‑1病毒复制；其中所述第一和第二荧光蛋白编码序列编码不同的荧光蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及神经生物学，并且更具体地涉及顺行(anterograde)跨单级突触神经(monosynaptictransneuronal)示踪系统。
技术介绍
绘制大脑连接组对了解大脑是如何工作来说是必不可少的。作为神经功能的基本单位，神经环路在宏观结构/功能和微分子/信号环路间起到桥梁的作用。然而，许多特定的功能神经环路的结构，包括组件，连接和分布，仍有待阐明。新的示踪技术和示踪工具，特别是病毒示踪工具，有助于发现新的环路和揭示已知的典型环路的新功能。病毒示踪工具已经用于神经科学研究。狂犬病病毒(RV)和伪狂犬病病毒(PRV)的衍生病毒示踪工具有能力追踪神经环路去标记输入神经网络(1)。重组水泡口炎病毒(VSV)用于顺行或逆行跨突触环路示踪(2，3)。人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)毒株H129(H129)是一个潜在的顺行跨突触神经环路的示踪工具(4,5)。然而，跨多级突触病毒示踪工具在确定直接或非直接投射靶标时引起不可避免的模糊。因此，迫切需要的是开发顺行跨单级突触神经示踪系统，为了明确地确定直接投射靶标。
技术实现思路
本专利技术提供了顺行跨单级突触(monosynaptictransneuronal)病毒示踪系统,用于绘制在一个特定的脑核团的特殊类型神经元的直接后突触靶标。在一个实施例中，所述顺行跨单级突触病毒示踪系统包括H129衍生的重组缺陷型病毒，其包含整合的第一表达盒含有第一启动子、第一荧光蛋白编码序列，和抗性肽编码序列，其中第一表达盒代替整个或部分胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因序列，产生的H129衍生的重组缺陷型病毒丧失了TK功能(H129-ΔTK-tdT)；和AAV9衍生的重组AAV9辅助病毒(AAV9-TK-GFP和AAV9-DIO-TK-GFP)，可补偿TK，其包含整合的第二表达盒含有第二启动子、TK编码序列，连接子肽编码序列，和第二荧光蛋白编码序列，其中第二表达盒的TK表达使H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒复制；其中所述第一和第二荧光蛋白编码序列，编码不同的荧光蛋白。通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本专利技术的目的和优点是显而易见的。附图说明本专利技术的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。图1、(a)H129-wt基因组的结构示意图；(b)H129-G1基因组结构示意图；(c)H129-ΔTK-tdT基因组结构示意图；(d)构建pUS-F6；(e)构建H129-G1；(f)H129-G1单克隆PCR验证结果；(g)伴随病毒复制的GFP表达的GFP信号和导致的细胞病变效果；(h)WesternBlot检测病毒蛋白；(i)VERO细胞中H129-wt和H129-G1生长曲线；(j)鼠胚海马神经元和VERO细胞中H129-G1和H129-ΔTK-tdT生长曲线。图2、(a)辅助病毒AAV9-TK-GFP基因组的结构示意图；(b)辅助病毒AAV9-DIO-TK-GFP基因组的结构示意图。图3、用本专利技术的一个实施例的顺行跨单级神经病毒示踪系统绘制野生小鼠来自VPM的直接投射。图4、用本专利技术的一个实施例的顺行跨单级神经病毒示踪系统绘制DAT-Cre小鼠来自VTA-DA神经元的直接投射。图5、用本专利技术的一个实施例的顺行跨单级神经病毒示踪系统绘制PV-Cre小鼠来自nRT-PV神经元的直接投射。具体实施方式可以通过引用以下的本专利技术的某些实施例的详细描述而更容易地理解本专利技术。在本申请中，为了更充分地描述本专利技术所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本申请。除非另有说明，在本专利技术的实践将采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学，核酸化学和免疫学的现有技术，这些是在本领域的技能之内。这些技术在文献中已有完全解释，如分子克隆：实验室说明书，第三版(Sambrook和Russel，2001年)；分子生物学当代程序(FMAusubel等主编，1987年，包括补充至2001年)。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是一种普遍存在的、条件致病病原。其自然神经嗜性和跨神经突触的传播能力使其成为潜在的神经环路示踪工具。HSV-1毒株McIntyre-B逆行传播，而HSV-1毒株H129优先顺行跨神经突触传播[7-9]。许多研究在不同的途径和不同的动物模型中的应用了这种病毒[7,10-13]。特别是，表达遗传改变的荧光蛋白(FP)的H129的研发促使了探索该病毒株在顺行神经环路中的示踪[14,15]。然而，由于有限的标记强度，这些H129衍生的示踪工具无法让突触环路可视化，也无法显示神经元形态的细节[14,15]。腺相关病毒(AAV)感染人类和其他灵长类动物。该病毒是一个小的(病毒颗粒直径约20nm)，复制缺陷型，无囊膜病毒。AAV基因组是单链脱氧核糖核酸(DNA)，大约4700个碱基长。基因组包括在DNA链的两端的反向末端重复序列(ITRS)，和两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。前者是由四个重叠基因组成，编码Rep蛋白的，为腺病毒生命周期相关的所需，后者包含重叠的衣壳蛋白的核苷酸序列：VP1、VP2、VP3，相互作用在一起形成二十面体对称的衣壳。本专利技术提供顺行跨单级神经(monosynaptictransneuronal)病毒示踪系统，用于绘制在任一给定脑核团的特定神经类型的直接后突触靶标。简而言之，所述顺行跨单级突触病毒示踪系统包括H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒，和AAV9衍生的重组AAV9辅助病毒。所述H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒包含整合的第一表达盒含有第一启动子、第一荧光蛋白编码序列，和抗性肽编码序列，其中第一表达盒代替整个或部分胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因序列，产生的H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒H129丧失TK功能。所述AAV9衍生的重组AAV9辅助病毒包含整合的第二表达盒含有第二启动子、TK编码序列，连接子肽编码序列，和第二荧光蛋白编码序列，其中第二表达盒的TK表达使H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒复制。在一些实施例中，所述第一和第二启动子是选自CMV启动子,SV40启动子,CAG启动子，EF1a启动子，TH(tyrosinehydroxylase)启动子和Syn1启动子。所述第一和第二神经元细胞特异性启动子可以是相同或不同的。在一些实施例中，第一启动子是神经元细胞特异性的。在一些实施例中，适用于本专利技术的荧光蛋白编码序列可以是在目前或将来可用的任何荧光基因。荧光基因可以是野生型的或重组衍生，只要他们的荧光强度不降低。例如，所述荧光蛋白编码序列包括GFP(greenfluorescentprotein)，eGFP(enhancedgreenfluorescentprotein)，mGFP(membraneboundformofEGFP)，sfGFP(superfoldergreenfluorescentprotein)，EYFP(enhancedyellowfluorescentprotein)，ECFP(enhancedcyanfluorescentprotein)，EBFP2(enhancedbluefluorescentprotein2)，tdTomato，MR本文档来自技高网...

【技术保护点】
顺行跨单级突触(monosynaptic transneuronal)病毒示踪系统,用于绘制在一个特定的脑核团的特殊类型神经元的直接后突触靶标，其特征在于，所述顺行跨单级突触病毒示踪系统包括：H129衍生的重组缺陷型HSV‑1病毒，其包含整合的第一表达盒含有第一启动子、第一荧光蛋白编码序列，和抗性肽编码序列，其中第一表达盒代替整个或部分胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因序列，产生的H129衍生的重组缺陷型HSV‑1病毒H129丧失TK功能；和AAV9衍生的重组AAV9辅助病毒，其包含整合的第二表达盒含有第二启动子、TK编码序列，连接子肽编码序列，和第二荧光蛋白编码序列，其中第二表达盒的TK表达使H129衍生的重组缺陷型HSV‑1病毒复制；其中所述第一和第二荧光蛋白编码序列，编码不同的荧光蛋白。

【技术特征摘要】
1.顺行跨单级突触(monosynaptictransneuronal)病毒示踪系统,用于绘制在一个特定的脑核团的特殊类型神经元的直接后突触靶标，其特征在于，所述顺行跨单级突触病毒示踪系统包括：H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒，其包含整合的第一表达盒含有第一启动子、第一荧光蛋白编码序列，和抗性肽编码序列，其中第一表达盒代替整个或部分胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因序列，产生的H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒H129丧失TK功能；和AAV9衍生的重组AAV9辅助病毒，其包含整合的第二表达盒含有第二启动子、TK编码序列，连接子肽编码序列，和第二荧光蛋白编码序列，其中第二表达盒的TK表达使H129衍生的重组缺陷型HSV-1病毒复制；其中所述第一和第二荧光蛋白编码序列，编码不同的荧光蛋白。2.根据权利要求1所述顺行跨单级突触病毒示踪系统，其特征在于，所述第一和第二启动子是选自CMV启动子,SV40启动子,CAG启动子，EF1a启动子，TH启动子和Syn1启动子；所述第一和第二启动子可以是相同或不同的。3.根据权利要求1所述顺行跨单级突触病毒示踪系统，其特征在于，所述荧光蛋白编码序列是选自GFP，eGFP，mGFP，sfGFP，EYFP，ECFP，EBFP2，tdTomato，MRFP，mCherry，Ypet，mKO，和mkate；其中第一和第二荧光蛋白编码序列编码不同的荧光蛋白。4.根据权利要求1所述顺行跨单级突触病毒示踪系统，其特征在于，所述抗性肽编码序列是选自ZeoR(zeocin)，AmpR(ampicillin)和CamR(chloramphenicol)。...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗敏华，曾文波，江海飞，赵非，杨虹，宋一舸，谌章舟，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42