本发明专利技术涉及麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用。麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术还涉及麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase在制备生产海藻糖中的应用。本发明专利技术首次发现了由氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)提取获得的麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，该基因表达的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase显著优于现有已知的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，该酶与同样来源于氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)的MTSase共同作用生产海藻糖时，产率高，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用，属于基因工程
技术介绍
海藻糖是由两分子葡萄糖通过α-1,1糖苷键结合而成的一种安全的非还原性二糖，广泛存在于植物、动物及微生物中。海藻糖具有广泛的生物学意义，在医药中是一种很好的稳定剂，可用来保护激素、维生素、抗生素、生物制剂、酶、抗血清、疫苗等易失活的物质；在化妆品中可以维持细胞活力，具有保湿、抗辐射的作用；在农业中可维持作物在高温、高旱、高盐条件下的正常生长；在食品中被用作改善质量和风味的天然添加剂，同时还具有保鲜的作用；因此在科学界被誉为“生命之糖”。目前生产海藻糖的方法主要包括单酶法以及双酶法。单酶法主要利用海藻糖合酶以麦芽糖为底物生成海藻糖，但该酶的稳定性差，极易失活，目前并没有利用该工艺大规模生产海藻糖的报道。双酶法是利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以直链淀粉为底物直接催化生成海藻糖。MTSase主要催化分子内转糖基反应，将淀粉的还原性末端的α-1,4-糖苷键转化为α-1,1-糖苷键，得到中间产物麦芽寡糖基海藻糖；MTHase专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖连接的α-1,4-糖苷键，产生一分子海藻糖和减少2个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，并作为新的底物进行下一轮反应。目前双酶法是最经济实用的工艺路线，且被应用于工业化生产。麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶最早在节杆菌(Arthrobactorsp.StrainQ36)中被发现报道，后来又在根瘤菌(Rhizobiumsp.StrainM11)，微黄短杆菌(Brevibactieriumhelvolum)，嗜酸热硫化叶菌(SulfolobusacidocaldariusATCC33909)中相继发现了这两种酶。不同来源的MTSase和MTHase具有不同的酶学特性，Arthrobactorsp.StrainQ36的最适反应温度40℃、pH6.5，转化率高达80％，SulfolobusacidocaldariusATCC33909具有较高的最适反应温度75℃以及较低的pH5.0，但酶活力均很低。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供麦芽寡糖基海藻糖水解酶及其表达基因与应用。本专利技术技术方案如下：麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。上述麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。一种重组表达载体，表达载体中插入了上述表达基因MTHase。优选的，所述表达载体为表达载体pET-22b(+)。一种重组细胞，含有上述重组表达载体。优选的，所述的重组细胞通过将上述表达载体转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)后获得。上述麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase、上述表达基因MTHase、上述重组细胞在制备生产海藻糖中的应用。有益效果本专利技术首次发现了由氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)提取获得的麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，该基因表达的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase最适温度为57℃，最适pH5.5，以20％麦芽五糖为底物生产麦芽五糖基海藻糖，酶活可达到35.7U/ml，显著优于现有已知的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，该酶与同样来源于氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)共同作用生产海藻糖时，产率高，具有广阔的应用前景。附图说明图1是MTSase、MTHase基因获得过程的流程图；图2是MTSase基因PCR扩增后的电泳检测结果照片；图3是MTHase基因PCR扩增后的电泳检测结果照片；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。菌种来源所述氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)购自中国普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏编号NO.1.1925。实施例1：氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)基因组总DNA的提取。将-80℃下保存的氧化节杆菌(Arthrobacteroxydans)菌株接种至LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L)中活化培养24小时，其后按照1％接种量接种至新鲜LB培养基中培养24小时，取10mL菌液按照上海生工细菌基因组提取试剂盒所提供的方法提取该菌基因组总DNA。实施例2：MTSase、MTHase基因的获取MTSase、MTHase基因的获取如图1所示，根据同源比对分别设计简并引物F1和R1、F2和R2。F1：GGTTCCGSGTGSGASGTGAAGAACTGCCAR1：TTGGCCATSACCATKCCSGAGGTCTGCTGGAAF2：ATCTACGARCTSCACSTGGGCACCTTR2：GGTTCCGSGTGSGASGTGAAGAACTGCCA以实施例1制得的基因组总DNA为模板，分别以F1(上游引物)、R1(下游引物)和F2(上游引物)、R2(下游引物)为引物，利用TaKaRa公司的ExTaqTM试剂盒根据产品说明书进行PCR扩增；所述PCR扩增体系如下：基因组DNA2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH2O19μL。PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。凝胶电泳分别得到两条1000bp左右条带，割胶回收。将PCR产物分别与pTOPO-T载体连接转化进DH5α中，挑选阳性克隆子，送至上海生工测序，记做测序结果1。根据测序结果1与同源序列设计简并引物F3和R3、F4和R4、F5和R5。F3：ACSCGGCGGTAGGGCATGGWTTCR3：CCGGGCAGTGGAGCGACGACTF4：CCCGCCGTAGCCTTCATGGACR4：ACCTCGGGAATGGTCATGGCF5：CTTGTCCAGGTCGTCGTCCGAGR5：CTTGTCCAGGTCGTCGTCCGAG以实施例1制得的基因组总DNA为模板，分别以F3(上游引物)和R3(下游引物)、F4(上游引物)和R4(下游引物)、F5(上游引物)和R5(下游引物)为引物，利用TaKaRa公司的ExTaqTM试剂盒根据产品说明书进行进行PCR扩增；所述PCR扩增体系如下：基因组DNA2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH2O19μL。PCR条件为：95℃变性5min；95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；凝胶电泳分别得到1000bp、1000bp、1500bp左右条带，割胶回收。将PCR产物分别与pTOPO-T载体连接转化进DH5α中，挑选阳性克隆子，送至上海生工测序，记做测序结果2。根据测序结果2可得到MTSase和MTHase基因首尾碱基序列，以及目标载体pET-22b序列，借助引物设计软件CEDesignV1.03设计无缝克隆多片段嵌合体引物F6和R6，F7和R7。黑体部分为酶切位点NdeI和XhoI。F6：taagaaggagatataAGGGTCCCGGCA本文档来自技高网...
【技术保护点】
麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.麦芽寡糖基海藻糖水解酶表达基因MTHase，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，表达载体中插入了权利要求1所述表达基因MTHase。4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为表...
【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞明，薛乐平，王腾飞，汪俊卿，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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