定点诱变TREM‑1抗体以降低黏度制造技术

描述了能够特异性结合TREM‑1并阻止其活化的抗体，其具有良好的亲和力和在临床相关浓度下的低黏度，TREM‑1是一种在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中表达的蛋白。此类抗体可用于治疗患有炎性疾病诸如类风湿性关节炎和炎症性肠病的个体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及TREM-1mAb，并涉及参与TREM-1mAb自身相互作用或TREM-1mAb与TREM-1相互作用的特定的带负电和不带电氨基酸的突变，以降低mAb溶液黏度并维持靶标亲和力，并且本专利技术涉及此类抗体在治疗和药物使用中的用途。本专利技术的序列表SEQIDNO:1代表野生型（wt）人TREM-1的氨基酸序列。SEQIDNO:2代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（WO2013/120553中的mAb0170）。SEQIDNO:3代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（WO2013/120553中的mAb0170）。SEQIDNO:4代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0317，E27Q、E97S）。SEQIDNO:5代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0318，E27Q、E97Q）。SEQIDNO:6代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0319，E97S）。SEQIDNO:7代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0320，E97Q）。SEQIDNO:8代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0321，E27Q）。SEQIDNO:9代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0322，F32A）。SEQIDNO:10代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0323，F32S）。SEQIDNO:11代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb0324，A59Y）。SEQIDNO:12代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb0325，N57S）。SEQIDNO:13代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb0326，A59Y、N57S）。SEQIDNO:14代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb0330，F32A、E27Q、E97Q）。SEQIDNO:15代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb0332，A59Y；0332是由SEQIDNO:15作为HC和SEQIDNO5作为LC组合而成的mAb,表1）。SEQIDNO:16代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb0333，A59Y；0333是由SEQIDNO:16作为HC和SEQIDNO14作为LC组合而成的mAb,表1）。SEQIDNO:17代表全长cTREM-1的氨基酸序列。SEQIDNO18代表mAb0170的Fab区的重链。SEQIDNO19代表mAb0170的Fab区的轻链。专利技术背景TREM-1是在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上表达的活化受体。这些细胞通过释放驱动炎症的细胞因子和其它介质而在慢性炎性疾病中起主要作用。TREM-1mRNA和蛋白质表达在具有RA和IBD的患者中上调，且TREM-1阳性细胞在炎症部位积累，其与疾病严重程度相关。主要由活化的嗜中性粒细胞表达的肽聚糖识别蛋白1（PGLYRP1）是TREM-1的配体，并在结合后介导TREM-1信号传导。在体外，TREM-1的参与触发促炎细胞因子（包括TNF、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1）的分泌。另外，TREM-1信号传导与多种Toll-样受体（TLR）协同作用以进一步强化促炎信号。继而，该TREM-1上调表达导致恶性循环从而扩大炎症。越来越多的证据表明TLR有助于慢性炎性疾病诸如RA和IBD的发展和进程。WO2013/120553公开了人源化抗-TREM-1mAb，其抑制人和食蟹猴TREM-1两者的功能。但是，抗-TREM-1mAb的黏度概况可阻碍以>50mg/ml生产药物产品的制备过程，并且可限制临床中的最优剂量设置。通常需要高剂量的蛋白质治疗剂（若干mg/kg）以实现适当的临床效果，并且由于这些治疗剂的绝大多数通过皮下递送施用，因此所述治疗剂的患者自我施用受限于<1.5mL的体积（Shire等人,J.Pharm.Sci.2004,93,1390-1402）。当蛋白制剂导致所得溶液的高黏度时，开发适合用于患者自我施用的高浓度蛋白制剂通常受阻于制备和递送。已经针对在mAb溶液的黏度表现上的作用对mAb的电荷分布进行了研究（Ydav等人,Mol.Pharmaceutics2012,9,791-802）。同样，已经显示存在于稀释溶液中的弱的非荷质比相互作用影响浓缩的mAb溶液的黏度（Connolly等人,Biophys.J.,2012,103,69-78.）。减少mAb溶液黏度的补救方法是引入破坏直接的电荷-电荷分子间相互作用的定点电荷交换突变(Ydav等人,Mol.Pharmaceutics2012,9,791-802)或添加盐或反离子（Liu等人,J.Pharm.Sci.2005,94,1928-1940;Yadav等人,J.Pharm.Sci.2010,99,1152-1168;Yadav等人,J.Pharm.Sci.2012,101,998-1011;Kanai等人,J.Pharm.Sci.2008,97,4219-4227）。但是，盐和反离子的添加可以就所施用溶液的高渗性而导致对患者的副作用。本文公开的是通过位点特异性突变在WO2013/120553中公开的人源化抗-TREM-1mAb0170的CDR而生成的TREM-1抗体。本公开的抗体不破坏直接的mAb分子间电荷-电荷自我相互作用，但是具有有利的黏度概况和维持的靶标结合概况。有利的黏度概况允许以高浓度生产药物产品，其对于治疗和药物使用将是关键的。此类抗体可以对患有脓毒病或慢性炎症疾病诸如类风湿性关节炎、银屑病关节炎和炎症性肠病的个体的生活质量具有实质影响。专利技术概述本专利技术的主要方面涉及具有在单体mAb期望的范围内的黏度概况的抗-TREM-1mAb，且所述抗-TREM-1mAb如WO2013/120553的mAb0170一样有力地阻断TREM-1功能。在本专利技术的变体mAb的有利黏度概况以外，所述变体对TREM-1受体不具有激动作用。本专利技术的一个方面涉及能够结合并阻断TREM-1的抗体或其片段，其特征在于所述抗体或所述抗体的抗体片段在80mg/mL的浓度下具有小于5cP，优选小于4cP的黏度。所述抗体或其片段可包括SEQIDNO:3的变体，其中SEQIDNO:3的CDR1和CDR3区中的一个或多个带负电残基被不带电氨基酸残基取代，如本文所述。所述抗体或其片段可包括SEQIDNO:3的变体，其中在SEQIDNO:3的位置32的苯丙氨酸被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸，优选地选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸缬氨酸和亮氨酸，更优选地其中SEQIDNO:3的F32被突变为丙氨酸或丝氨酸。所述抗体或其片段可包括SEQIDNO:2的变体,其中SEQIDNO:2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ.IDNO3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98中的任一个（“Fab-Fab相互作用”突变）被另一种氨基酸取代，所述另一种氨基酸是诸如天然氨基酸，优选地选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够结合并阻断TREM‑1的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或片段在80 mg/mL的浓度下具有小于5 cP，优选小于4 cP的黏度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.17 EP 14177547.8;2014.11.26 EP 14194893.51.能够结合并阻断TREM-1的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或片段在80mg/mL的浓度下具有小于5cP，优选小于4cP的黏度。2.抗体或其片段，其中SEQIDNO:3的CDR1和CDR3区中的一个或多个带负电残基被不带电氨基酸残基取代。3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其包含SEQIDNO:3的变体，其中SEQIDNO:3的残基D1、D30、D33、D74、D98、E27、E97（“电荷补丁”突变）中的任何一个或多个被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。4.根据权利要求3所述的抗体或其片段，其中SEQIDNO3的CDR1和CDR3区的E27和E97中的至少一个或两者被不带电氨基酸残基取代，所述不带电氨基酸诸如选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。5.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQIDNO3的E27被突变为谷氨酰胺且E97被选自甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。6.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQIDNO3的E97被突变为谷氨酰胺且E27被选自甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。7.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQIDNO:3的E27和E97被突变为谷氨酰胺。8.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQIDNO3的E27保持未突变而E97被突变为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸，更优选突变为选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。9.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQIDNO3的残基E97保持未突变而E27被选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。10.抗体或其片段，其包含SEQIDNO:2的变体，其中SEQIDNO:2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ.IDNO3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98（“Fab-Fab相互作用”突变）中的任一个被另一种氨基酸取代，所述另一种氨基酸是诸如天然氨基酸，优选地是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸。11.根据权利要求10所述的抗体或其片段，其中S...

【专利技术属性】
技术研发人员：A亨里克森，K克耶加德，V韦斯特法尔斯滕尼克，C维贝里，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK