结合人Vγ9Vδ2 T细胞受体的免疫球蛋白制造技术

本发明专利技术属于医药领域，且涉及免疫学，尤其涉及人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子。人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子尤其用于医学治疗和/或用于人Vγ9Vδ2 T细胞的检测，其中人Vγ9Vδ2 T细胞是可调节的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于医药领域，且涉及免疫学。本专利技术涉及结合T细胞的免疫球蛋白。本专利技术尤其涉及结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的免疫球蛋白。本专利技术提供结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的免疫球蛋白分子，例如抗体、单链抗体或单域抗体，其中所述人Vγ9Vδ2T细胞是可调节的。
技术介绍
成人中的大多数γδ外周血淋巴细胞(PBLs)表达包含Vγ9区和Vδ2区的T细胞受体(TCR)。Vγ9Vδ2T细胞可与广泛的病原体和肿瘤细胞反应。这种广泛的反应性被理解为由能够以TCR依赖性方式特异性地激活该T细胞亚群的磷酸抗原赋予。Vγ9Vδ2T细胞的广谱抗微生物和抗肿瘤反应性表明直接参与癌症和感染的免疫控制。除了抗击疾病之外，在一些疾病或医学治疗中Vγ9Vδ2T细胞可能被过度刺激或无意激活。因此，因为可激活Vγ9Vδ2T细胞的试剂可以促进Vγ9Vδ2T细胞对病原体或感染的细胞或癌症的反应性，所以这些试剂可用于治疗感染或癌症。此外，阻断Vγ9Vδ2T细胞激活的试剂可用于其中有利于减少Vγ9Vδ2T细胞激活的疾病或医学治疗，即其中Vγ9Vδ2T细胞被过度刺激或无意激活。最后，可结合Vγ9Vδ2T细胞但对Vγ9Vδ2T细胞(磷酸抗原)激活没有作用的试剂可用于标记细胞，例如用于筛选或鉴定Vγ9Vδ2T细胞。因此，本领域需要提供可结合Vγ9Vδ2T细胞的试剂，以及可以阻断Vγ9Vδ2T细胞的磷酸抗原激活或可激活Vγ9Vδ2T细胞的试剂。专利技术概述本专利技术现提供可结合Vγ9Vδ2T细胞的新试剂。所提供的试剂为免疫球蛋白。所提供的免疫球蛋白结合Vγ9Vδ2T细胞受体。意外地发现，本专利技术提供的免疫球蛋白具有实质的序列同一性。因此，在本专利技术的第一方面，提供了结合人Vγ9Vδ2T细胞受体的免疫球蛋白分子，其包含CDR1区和CDR2区，其中，CDR1区包含与SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和其中CDR2区包含与SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；其中，优选地免疫球蛋白分子为单域抗体。此外，该免疫球蛋白包含CDR3区，其中，CDR3区有助于Vγ9Vδ2T细胞受体结合并且可对免疫球蛋白分子的作用具有影响。在不受理论约束的情况下，这可以使CDR3序列涉及免疫球蛋白分子的功能，即调控类型，例如阻断Vγ9Vδ2T细胞的激活、诱导Vγ9Vδ2T细胞的激活或既不阻断也不诱导Vγ9Vδ2T细胞的激活。本专利技术的免疫球蛋白尤其用于医学治疗和用于涉及Vγ9Vδ2T细胞的测定中。优选地，本专利技术的免疫球蛋白分子包含CDR3区，其中CDR3区包含选自氨基酸序列SEQIDNO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的组的氨基酸序列。如下文详细讨论的，提供这些与CDR1和CDR2序列结合的CDR3区用于结合和功能。附图说明图1：VHH序列的比对，其中显示框架区(1、2、3和4)以及CDR1、CDR2和CDR3。还显示每个VHH的编码(即5C7是VHH5C7的序列)。图2：VHH5E7和VHH6F6不激活Vγ9Vδ2T细胞。数据通过健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞与阳性对照(表达磷酸抗原(pAg+)的HeLa细胞)比较来表明激活标记CD25、促炎性细胞因子IFN-γ和细胞毒性分子颗粒酶B的相对表达。图3：VHH5E7中和了健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞的磷酸抗原诱导的激活。一个典型的实例证明了使用VHH5E7磷酸化Ag诱导的Vγ9Vδ2T细胞激活的剂量依赖性中和，而非特异性VHH(阴性对照)不能中和磷酸化Ag诱导的Vγ9Vδ2T细胞激活。纵轴表示通过CD25表达评估Vγ9Vδ2T细胞的激活，横轴表示不同的VHH浓度。使用表达磷酸抗原的HeLa细胞进行Vγ9Vδ2T细胞刺激，表达磷酸抗原的HeLa细胞通过用递增剂量的氨基双膦酸帕米膦酸盐(aminobisphosphonatepamidronate)(其导致HeLa细胞的磷酸抗原表达水平增加)预处理HeLa细胞而产生。图4：Vγ9Vδ2TCR特异性VHH能够在健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞中诱导激活和细胞因子产生。数据通过健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞与阳性对照(表达磷酸抗原(pAg+)的HeLa细胞；标准化为1)和阴性对照VHH比较来表明激活标记CD25和促炎性细胞因子IFN-γ的相对表达。每个条代表单个Vγ9Vδ2TCR特异性VHH；在Vγ9Vδ2T细胞中单个VHH在诱导激活和细胞因子产生的能力方面不同。图5：健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞的剂量依赖性激活。数据表示用递增浓度(10-100-500nM)的非激活的抗-Vγ9Vδ2TCRVHH或激活的抗-Vγ9Vδ2TCRVHH刺激24小时后的CD25表达(MFI)的变化。图6：当与作为双特异性分子的肿瘤抗原特异性VHH融合时，Vγ9Vδ2TCR特异性VHH可促进肿瘤细胞死亡。在实验的典型实例中，在存在(有)或不存在(没有)双特异性纳米抗体构建体的情况下，Vγ9Vδ2T细胞与肿瘤细胞系A431共培养过夜，双特异性纳米抗体构建体由与激活抗-Vγ9Vδ2TCRVHH融合的肿瘤抗原特异性VHH组成。数据表明Vγ9Vδ2T细胞和7AAD+肿瘤细胞(表明肿瘤细胞死亡)的CD25表达(激活)和CD107a表达(脱粒)。图7：使用流式细胞计数法测定的T细胞受体Vγ9和/或Vδ2结合特异性：典型的流式细胞计数法直方图表明Vγ9Vδ2TCR特异性VHH(空心直方图)和阴性对照VHH(填充的直方图)与Vγ9Vδ2TCR表达细胞的结合。图8：克隆VHH5C7不激活健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞，也不中和磷酸抗原诱导的健康供体来源的Vγ9Vδ2T细胞的激活。典型的实例证明VHH5C7对磷酸Ag诱导的Vγ9Vδ2T细胞激活没有抑制和激活作用。纵轴表示通过CD25表达评估的Vγ9Vδ2T细胞的激活，横轴表示不同的VHH浓度。使用表达磷酸抗原的HeLa细胞进行Vγ9Vδ2T细胞刺激，表达磷酸抗原的HeLa细胞通过用递增剂量的氨基双膦酸帕米膦酸盐(其导致HeLa细胞的磷酸抗原表达水平增加)预处理HeLa细胞而产生。图9：免疫球蛋白的示意图。A)由两条重链和两条轻链组成的人抗体；B)由可通过二硫桥键二聚化的两条单链(或两条重链)组成的单链抗体(或仅重链抗体)，其中每条链含有可变结构域。这种单链抗体(或仅重链抗体)可以是美洲驼抗体；C)单域抗体含有一个可变抗体结构域，例如单链抗体(或仅重链抗体)。单域抗体可仅由所描述的结合区组成。可变结构域用灰色表示，而恒定区用白色表示。轻链的可变结构域用黑色表示。定义：在下面的描述和实施例中，使用了多个术语。为了提供对说明书、权利要求和条款的清楚和一致的理解，包括给予这些术语的范围，提供以下定义。除非本文另有定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。实施本专利技术的方法中使用的常规技术的方法对于本领域技术人员是显而易见的。分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
人Vγ9Vδ2 T细胞受体结合免疫球蛋白分子，其包括CDR1区和CDR2区；其中所述CDR1区包含与SEQ ID NO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和其中所述CDR2区包含与SEQ ID NO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；和其中优选地所述免疫球蛋白分子为单链抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.10 NL 20126041.人Vγ9Vδ2T细胞受体结合免疫球蛋白分子，其包括CDR1区和CDR2区；其中所述CDR1区包含与SEQIDNO.31的氨基酸序列GRTFSNYAMG具有至少40％序列同一性的氨基酸序列；和其中所述CDR2区包含与SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；和其中优选地所述免疫球蛋白分子为单链抗体。2.根据权利要求1所述的免疫球蛋白分子，其中所述CDR2区包含与SEQIDNO.32的氨基酸序列AISWSGGSTYYADSVKG具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在位置9具有T、在位置12具有A，以及在位置15具有V。3.根据权利要求1或2所述的免疫球蛋白分子，其中所述免疫球蛋白分子为单链抗体，优选地，其中所述单链抗体为美洲驼单链抗体或人单链抗体。4.根据权利要求1或2所述的免疫球蛋白分子，其中所述免疫球蛋白分子为单域抗体，优选地，其中所述单域抗体为美洲驼单域抗体或人单域抗体。5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫球蛋白分子，其包含一个或多个选自SEQIDNO.67-70的氨基酸序列的框架区。6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫球蛋白分子，其包括CDR3区，其中所述CDR3区包含选自氨基酸序列SEQIDNO.3、6、9、11、14、17、20、22、25、27、29、30、33、35、37、40、43和46的组的氨基酸序列。7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫球蛋白分子，其具有来自表1所列的抗体的CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列的组合。8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白分子，其中所述免疫球蛋白分子具有选自SEQIDNO.47-66的氨基酸序列的氨基酸序列。9.编码权利要求1-8中任一项所述的免疫球蛋白分子的核苷酸序列。10.宿主细胞，其包含权利要求9所述的核苷酸序列。11.制备权利要求1-8中任一项所述的免疫球蛋白分子的方法，其包括：-培养权利要求10所述的宿主细胞；-允许所述宿主细胞表达所述免疫球蛋白；-获得所述免疫球蛋白。...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰内斯·耶勒·范德弗利特，蕾妮·科妮莉亚·格拉里达·德布鲁恩，坦尼亚·丹妮丝·德格鲁伊杰，亨德里克·马里纳斯·威廉·费尔霍伊尔，
申请(专利权)人：大学医疗中心基金会，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL