(S)-1,2-戊二醇的生物制备制造技术

本发明专利技术公开了来源于Candidamagnolia的羰基还原酶CMCR与葡萄糖脱氢酶GDH耦合应用于(S)-1,2-戊二醇制备的方法。该方法与现有的化学方法相比，具有操作简单、反应条件温和、对环境友好、高产率、高对映选择性等优点，与现有的生物催化相比，底物浓度高，时空产率高达312公斤/吨/天，具备了工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物催化领域，涉及一种利用生物催化剂以1-羟基-2-戊酮为原料高效合成光学纯(S)-1,2-戊二醇的方法。
技术介绍
1,2-戊二醇是合成手性农药丙环唑的重要中间体。丙环唑(propiconazole)是由瑞士汽巴-嘉基公司开发的一种环唑类内吸性杀菌剂，国外的主要生产商是诺华公司，主要是以剂型形式向我国销售。其原油为淡黄色粘稠液体，沸点180℃／13.33Pa。从外贸及海关数据统计分析，全球丙环唑用量增长较快。2006年全球为2200吨，2007年为3800吨，2008年为4800吨，2009年接近6000吨，估计2010年最少也在6500吨左右。丙环唑的化学名称为：1-[2-(2,4-二氯苯基)-4-丙基-1,3-二氧戊环-2-甲基]-1H-1,2,4-三唑，丙环唑的分子结构中含有两个手性中心．即二氧戊环上的2-位和4-位各有一个不对称碳原子。二者都有光学异构体：由于饱和五元环的存在，每个光学异构体都存在2种几何异构体(顺、反)，这种独特的结构使其杀菌活性较高，其光学异构体结构如下：丙环唑作为叶面喷雾使用时杀菌活性由高至低顺序为:2S,4R>2S,4S>2R,4S>2R,4R，目前使用的仍为上述四个异构体的混合物。在丙环唑的使用中出现了如下药害症状：幼嫩组织硬化、发脆、易折；植株生长滞缓、矮化、组织坏死；种子处理时会延缓种子萌芽，并且药害情况频发。针对上述的情况，汽巴-嘉基公司进一步研究发现上述的四个异构体在杀菌活性方面的相差不大，但是2R,4S异构体不仅能够完全保持杀菌的活力，并且与其他构型的丙环唑相比，对植物生长没有明显的危害，2S,4S异构体同样对植物生长的危害也是其中较低的。（US4940799）根据丙环唑的合成路线，二氧戊环的形成是1,2-戊二醇与羰基缩合而成，因此，要获得4位为S构型的异构体，使用的原料须为(S)-1,2-戊二醇。(S)-1,2-戊二醇的合成目前主要分为化学法和生物法。化学法分为手性助剂和不对称催化两种。1999年，Hollingsworth报道了以D-葡萄糖为手性助剂，以1羟基2-戊烯为底物经过5步反应，使用醋酸汞、硼氢化钠、三氟化硼乙醚溶液、双氧水等试剂，最终分别获得(S)和(R)-1,2-戊二醇，但是该方法由于经过多步反应，在第三步后产物的产率为65%左右，文章中并没有对后两步三氟化硼还原和双氧水氧化后的产率报道（TetrahedronLett.,1999,40,581-584）。2006年，Hamada利用（R）-脯氨酸作为手性助剂，以正戊醛为原料经过两步反应，得到(S)-1,2-戊二醇（TetrahedronLett.,2006,47,1081-1085）。2009年，Kadyrov等合成了一系列的配体与金属Ru形成配合物，将其应用到1-羟基-2-酮底物不对称氢化中，其中当底物为1-羟基-2-戊酮时，底物浓度为0.3M，氢气压力为80bar，产率为74%，立体选择性（ee）为94%（Angew.Chem.Int.Ed.48,7556）。1995年Sharpless等以9O-位的不同修饰双氢奎尼丁作为催化剂，实现了戊烯的不对称双羟化，产物ee值最高可达88%（J.Org.Chem.,1995,60,3940）。生物法分为消旋体拆分和不对称还原。其中，研究较早的是1990年，Hasegawa等以1,2-邻二醇消旋体为底物利用整细胞中的不同构型氧化还原酶实现消旋体中一种构型的立体翻转，底物浓度为3g/L，产物ee值>99%，反应时间为24小时（Agric.Biol.Chem.,54,1819）。1993年，Poppe等人以1,2-双氧乙酰化的消旋体为底物，利用脂肪酶拆分，得到水解后的混合物，包括没有反应的S-构型双氧乙酰化底物，和1,2-位分别水解后的单氧乙酰化产物，ee值为>96%时，收率不高于30%（Tetrahedron:Asymmetry,4,2211）。1994年，Suzuki等利用脱氢-脱卤酶在添加吩嗪硫酸甲酯的条件下实现了消旋体1,2-戊二醇的选择性氧化，产物ee值为98.2%（Tetrahedron:Asymmetry,5,239）。结合文献调研发现，在手性1,2-戊二醇的合成中，底物浓度和产物的ee值没有能够同时兼得的方法，没有高效的(S)-1,2-戊二醇的合成方法，其下游产品丙环唑就无法实现手性的制备，因此能够建立一种(S)-1,2-戊二醇的高效合成方法是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种操作简单、反应条件温和、转化率高的生物催化剂催化制备(S)-1,2-戊二醇的方法。利用酶标仪筛选本实验室保存的酶催化剂，发现来源于Candidamagnolia的羰基还原酶CMCR能够实现1-羟基-2-戊酮的高活性、高立体选择性的还原，生成(S)-1,2-戊二醇。将底物1-羟基-2-戊酮和葡萄糖与溶剂、助溶剂构成反应体系，加入生物催化剂CMCR和葡萄糖脱氢酶GDH后在20°C~40°C，pH在5~9，反应4小时~36小时，制得光学纯的(S)-1,2-戊二醇。每升反应体系中生物催化剂的用量为0.1g~100g，所述的溶剂为水或缓冲溶液，助溶剂为二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺，二氧六环，甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，乙腈，四氢呋喃，正己烷，乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲基叔丁基醚，甲苯中的一种或多种。为了避免实验中辅因子NADP+的加入，降低生产成本，构建了羰基还原酶CMCR与葡萄糖脱氢酶GDH的共表达E.Coli菌株。将E.Coli缓冲重悬后，冻干备用。本专利技术具有如下优点：反应可以在水相中室温下进行，不需要高温高压等条件，在优化后的条件下底物转化率为99%，产物ee值99%。具体实施方式以下通过具体的实施例来进一步说明，但是这些实施例不构成对本专利技术的限制。实施例：1固体酶粉作为生物催化剂实现(S)-1,2-戊二醇的制备在1mL磷酸缓冲溶液(100mM,pH7.0)中，加入0.01mmol1-羟基-2-戊酮，CMCR酶粉1mg，葡萄糖脱氢酶粉GDH1mg，0.5mgNADP+，葡萄糖0.02mmol，30℃反应12小时，氯化钠饱和水相后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。GC检测底物转化率。为了检测产物的ee值，在乙酸乙酯相中加入10μL三甲基氯硅烷，90μLN,O-双三甲硅基乙酰胺，60℃反应1h实现对羟基的衍生化。反应的ee值结果如说明书附图。附图1为1,2-戊二醇消旋体衍生后的气相谱图，附图2为反应产物衍生后的气相谱图。实施例：2固体酶粉作为生物催化剂实现(S)-1,2-戊二醇的制备在0.9mL磷酸钠缓冲溶液(100mM,pH7.0)中，加入0.1mL二甲基亚砜，0.01mmol1-羟基-2-戊酮，CMCR酶粉1mg，1mg葡萄糖脱氢酶粉(GDH),0.5mgNADP+，葡萄糖0.02mmol，30℃反应12小时，氯化钠饱和水相后，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。实施例：3固体酶粉作为生物催化剂实现(S)-1,2-戊二醇的制备在0.9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用生物催化剂合成光学纯度>98% (S)‑1,2‑戊二醇的方法，包括：1‑羟基‑2‑戊酮作为底物与溶剂、助溶剂构成的反应体系；加入生物催化剂和辅酶循环体系进行催化还原反应，反应温度20~40℃，反应pH值为5~9，反应时间4~36小时，制得光学纯度>98% (S)‑1,2‑戊二醇。

【技术特征摘要】
1.一种用生物催化剂合成光学纯度>98%(S)-1,2-戊二醇的方法，包括：1-羟基-2-戊酮作为底物与溶剂、助溶剂构成的反应体系；加入生物催化剂和辅酶循环体系进行催化还原反应，反应温度20~40℃，反应pH值为5~9，反应时间4~36小时，制得光学纯度>98%(S)-1,2-戊二醇。
2.如权利要求1所述生物催化剂合成光学纯度>98%(S)-1,2-戊二醇的方法，其特征在于，所述的生物催化剂包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH或NADP+），来源于Candidamagnolia的羰基还原酶或者是与其氨基酸序列相似度不低于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，崔云凤，梅婷，陈启佳，刘祥涛，冯进辉，吴洽庆，朱敦明，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12