代谢优化的细胞培养物制造技术

本发明专利技术提供了用于在细胞培养物中大规模生产蛋白质和/或多肽的改良方法。本发明专利技术提供该方法用于培养已经代谢转换的细胞。使用这样的方法或系统允许生产高水平的蛋白质或多肽并降低不想要的代谢废物(诸如乳酸)的积累。根据本发明专利技术表达的蛋白质和多肽可以被有利地用于制备药物组合物、免疫原性组合物或其他商售的生物组合物，诸如抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【相关申请的交叉引用】本申请根据35USC§119(e)要求2013年10月11日递交的美国临时专利申请号61/889,815的权益，将其全文通过引用并入本文中。【专利
】本专利技术涉及细胞培养物中代谢转换(shift)成乳酸消耗的细胞。种子培养物中乳酸消耗代谢谱的切换(switch)对生产培养物具有有益的效果。一旦接种生产反应器，在补料分批的哺乳动物细胞培养物中，细胞显示出更有效的乳酸代谢，其具有低的乳酸生产速率、低的峰值乳酸水平、早转换成乳酸消耗以及随后增加的生产力。因此，本专利技术提供了一种用于在细胞培养物中大规模生产蛋白质和/或多肽的改良方法。【专利技术背景】生物学物质(特别是蛋白质和多肽)正被更常作为新的药物产品进行开发。生产非常高水平感兴趣的特定蛋白质的工程化细胞对于成功商业化生产这些药物干预变得极其重要。细胞培养物条件的控制和优化发生变化并对培养物中生产的治疗蛋白质的水平和治疗具有很大的影响。通常经分批或补料分批过程形式的细胞培养来制备蛋白质。小瓶解冻之后早期接种物生长包括以种子培养物的形式培养细胞。通常，以指数生长速率生长细胞，诸如在种子培养生物反应器中，以逐渐增加细胞群体的大小和/或体积。通过几个生物反应器阶段使得细胞团(cellmass)成比例放大之后，则将细胞转移至生产生物反应器而细胞仍然在指数生长(对数期)(Gambhir,A.等人，2003,JBioscienceBioeng95(4):317-327)。一般认为不希望使得分批培养物(例如种子培养物)中的细胞通过对数期进入平台期。已经建议，当培养物处于对数期的同时、在细胞(例如贴壁细胞)由于接触抑制或废物的积累抑制细胞生长连同其他原因而达到汇合之前，应当将培养物进行传代(CellCultureBasics,Gibco/InvitrogenOnlineHandbook,www.invitrogen.com；AnimalCellCultureGuide,www.atcc.org)。转移至补料分批培养之后，培养细胞一段时间，监测并控制培养基的组成以允许生产感兴趣的蛋白质或多肽。在达到特定的产率之后或者细胞活力、废物积累或营养耗尽决定应当终止培养，分离所生产的蛋白质或多肽。在过去的十年间试图提高重组蛋白质的产率已经发生许多显著的进步，所述产率目前达到每升许多克的效价。蛋白质制备方法中以及细胞系工程化和细胞培养基和进料发展中的进步已经对获得蛋白质产率做出了贡献。补料分批生产涉及随着细胞生长和产品生产的进行加入小体积的进料以补充生物反应器中存在的营养物。应当理解的是，哺乳动物细胞通常倾向于连续代谢碳水化合物导致乳酸积累，因此需要碱的加入以中和乳酸。碱的加入升高细胞培养基中重量克分子渗透压浓度，其进而大大限制生物反应器所能获得的总细胞活力和/或生产力。培养基中乳酸的积累对于细胞生长是有害的并且是限制分批培养中所能获得的最大生产力的常见因素之一。在典型的分批细胞培养中，培养物中的乳酸浓度达到约30-50mM和/或氨浓度达到3-5mM之后，生长和生产力被抑制(Ozturk,S.S.,Riley,M.R.和Palsson,B.O.1992.Biotechnol.andBioeng.39:418–431)。迄今为止，广泛应用的方案包括补充营养和设计化学成分确定的、无血清培养基以支持细胞的连续生长和最佳产物分泌。特别涉及降低细胞培养物中代谢废产物(诸如乳酸的积累)的输出的努力已经改善了最终蛋白质效价的总量。这些努力集中于受控葡萄糖或营养受限的补料分批方法(参见例如WO2004104186；US8192951B2)、改善的细胞培养基条件(例如US7390660；Zagari等人，2013,NewBiotechnol.,30(2):238-45)或细胞工程化，包括糖酵解途径中的靶向酶(例如Kim,S.H.和Lee,G.M.,2007,Appl.Microbiol.Biotechnol.74,152–159；Kim,S.H.andLee,G.M.,2007,Appl.Microbiol.Biotechnol.76,659–665；Wlaschin,K.F.和Hu,W-S.,2007,J.Biotechnol.131,168–176)。利用细胞的受控的进料以努力达到更有效的代谢表型(Europa,A.F.等人，2000,Biotechnol.Bioeng.67:25–34；Cruz等人，1999,BiotechnolBioeng,66(2):104-113；Zhou等人，1997,Cytotechnology24,99–108；Xie和Wang,1994,BiotechnolBioeng,43:1174-89)。但是，这由于下列事实而被复杂化：在高细胞密度的补料分批培养中所看到的营养耗竭以及例如氨浓度的快速改变能够诱导凋亡(“细胞程序性死亡”)(Newland等人，1994,Biotechnol.Bioeng.43(5):434-8)。因此，常见优化方法是以补料分批的形式生长细胞至适当高的密度，然后有意通过例如温度或pH改变诱导延长的、生产的平台期(Quek等人，2010,MetabEng12(2):161-71.doi:10.1016/j.ymben.2009.09.002。2009年10月13日电子出版)。优化技术(诸如同上所讨论的)已经集中于补料分批细胞培养，并且这种营养依赖的方法必须适用于被工程化以生产感兴趣的多肽的每种宿主细胞。使细胞适应培养物中的乳酸消费者的方法在制备生物治疗剂的方法中非常有希望。优化具有乳酸消耗的代谢表型的细胞系将证明有益于商业化生产多肽。【专利技术概述】本专利技术提供细胞和培养已经代谢转换成乳酸消耗的细胞的方法。代谢适应的细胞对于大规模蛋白质生产是理想的。本专利技术的一个方面是培养细胞的方法，其包括在第一培养物中已经发生细胞中代谢转换成乳酸消耗之后将细胞从第一细胞培养物转移至第二细胞培养物。本专利技术的另一个方面提供培养细胞的方法，其包括培养第一细胞培养物中的细胞，确定在第一细胞培养物中已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗，并在已经发生细胞中的代谢转换成乳酸消耗之后将细胞转移至第二细胞培养物，其中在第二细胞培养物中的乳酸浓度表示第二培养过程中的净乳酸消耗。在一个实施方案中，该方法进一步提供与除了在第一细胞培养物中已经发生代谢转换之前将细胞转移本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于培养细胞的方法，其包括：(a)在第一细胞培养物中培养细胞，(b)确定在所述第一细胞培养物中代谢转换成乳酸消耗已经发生，以及(c)所述细胞中代谢转换成乳酸消耗已经发生之后，将所述细胞转移至第二细胞培养物，其中所述第二细胞培养物中的乳酸浓度表示净乳酸消耗。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.11 US 61/889,8151.用于培养细胞的方法，其包括：
(a)在第一细胞培养物中培养细胞，
(b)确定在所述第一细胞培养物中代谢转换成乳酸消耗已经发
生，以及
(c)所述细胞中代谢转换成乳酸消耗已经发生之后，将所述细胞
转移至第二细胞培养物，
其中所述第二细胞培养物中的乳酸浓度表示净乳酸消耗。
2.权利要求1所述的方法，其中培养第一细胞培养物中的细胞之
前将所述细胞用编码感兴趣的多肽的DNA转染，并且包括在允许表
达所述感兴趣的多肽的条件下维持所述第二细胞培养物，以及从所述
第二细胞培养物收获所述感兴趣的多肽。
3.权利要求1或2所述的方法，其中通过测量所述第一细胞培养
物中的pH、乳酸或碱检测代谢转换成乳酸消耗。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中在没有加入碱的情况下
所述第一细胞培养物的培养基中pH升高之后检测代谢转换成乳酸消
耗。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中当所述第一细胞培养物
中的细胞离开对数期或已经达到平台期的时候代谢转换发生。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中当所述第一细胞培养物
中的乳酸水平达到稳定状态时代谢转换发生。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中在所述第一细胞培养物

\t中细胞生长的第3天或3天后代谢转换发生于所述第一细胞培养物中。
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中在所述第二细胞培养物
中，转移的细胞具有在大约0.5x106个细胞/mL至大约3.0x106个细
胞/mL之间的接种细胞密度。
9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中确定所述代谢转换的步
骤包括：
a.测量所述第一细胞培养物中的pH，
b.加入碱以维持pH大于预定的下限...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·劳伦斯，A·金，A·约翰逊，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US