一株海洋柴油降解菌BHB-16及其固定化方法技术

本发明专利技术筛选出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16，开发了一种可有效固定该菌株的方法并初步检测了该固定化方法对石油降解率的影响。所述可高效降解柴油的细菌为BHB-16，保藏编号为CGMCC No.11549，筛选自经柴油处理后的沿海沉积物中，该菌可在含0.2％(v:v)柴油的2216E固体培养基中正常生长，通过分析其16s DNA基因保守区域的核苷酸序列发现，该菌株为Lutibacterium菌属。以珊瑚石为吸附载体，该菌体可吸附在载体颗粒内外表面，形成柴油降解菌BHB-16与珊瑚石颗粒高度、紧密结合的产物，进而实现了珊瑚石载体颗粒对BHB-16的固定作用。上述菌株及其固定化方法可应用于海洋柴油降解过程中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，具体为筛选出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16，开发了一种可有效固定该菌株的方法并初步检测了该固定化方法对石油降解率的影响。
技术介绍
近年来，柴油已成为海洋的主要污染物质之一，主要通过沿海工业排放、海上油井、输油管道及船舶泄漏等多种途径进入海洋，而此类情况不仅会严重影响所污染地区的生态环境，同时也间接阻碍了中国沿海地区的经济发展。目前，针对柴油污染，尤其是大面积柴油泄漏，通常采用物理法、化学法以及生物修复的方法予以处理。一些物理方法如人工打捞等往往适用于突发性溢油的回收并控制溢油的扩散，但是处理效率受天气、海洋状况以及溢油类型影响；而如柴油乳化等化学方法，虽可以暂时清洁海面，但极易促使大量的原油沉降海底，引起海底荒漠化，进而诱发二次污染。生物修复技术具有成本低、操作简便、处理效果好等优点，因而现今被公认为最有前景的海洋污染治理方法。由于自然环境的复杂性，使得直接投加外源高效降解菌在自然环境下的柴油污染修复中往往难以达到预期效果，这促使污染海洋的生物修复日渐转向于依赖海洋微生物的降解作用，尤其是已经适应海底环境的各种土著柴油降解微生物，它们不仅可以克服海洋中各种极端条件，还可以以柴油为食，有效的对柴油进行分解转化，从而改变海洋生态环境。然而，由于许多微生物在水中通常以悬浮状态生长，菌体极易流失，这使得降解菌的浓度偏低，对柴油等污染物无法达到明显的降解效果。微生物固定化技术是从20世纪60年代开始迅速发展起来的一项新技术，主要通过利用物理或化学的方法将微生物定位于限定的空间区域，具有微生物密度高、反应迅速、微生物流失少等优点，将其应用于柴油污染的生物治理有着极大的应用潜力和发展前景。
技术实现思路
本研究筛选出一株可高效降解海洋柴油的菌株BHB-16，并以珊瑚石作为固定化载体,系统研究了该固定化材料对微生物的固定化效果以及固定化前后柴油降解菌株BHB-16对柴油的降解效率。本专利技术获得一株可高效降解柴油的细菌，该菌株为BHB-16(Lutibacterium)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.11549。本专利技术还公开一种对上文所述的细菌BHB-16的固定化方法，其步骤包括：①活化菌种BHB-16，菌浓度达OD600nm＝1.182～1.188；②将珊瑚石载体进行清洗、煮沸和烘干后，利用排水法准确称量其体积；③向步骤②所得珊瑚石载体中加入2216E液体培养基，灭菌后，再加入步骤①所得细菌BHB-16，所加珊瑚石载体颗粒、2216E液体培养基以及菌液的体积比例为(10～14)mL:60mL:(0.4～0.5)mL；于28～30℃、80～120rpm/min摇床中培养28～30h后，完成珊瑚石载体对细菌BHB-16的固定化。其中,载体颗粒、2216E液体培养基以及菌液的体积比例为12mL:60mL:0.4mL，培养温度为28℃，摇床转速为80rpm/min，培养时间为28h时，珊瑚石载体对细菌BHB-16菌液的固定化效果最佳。上文所述的对细菌BHB-16的固定化方法中，步骤①所述活化菌种BHB-16过程中使用的培养基为2216E液体培养基；培养条件为28～30℃、150～180rpm/min，当培养温度为28℃，摇床转速为150rpm/min时，菌体长势最好，菌浓度最高为OD600nm＝1.188。本专利技术上文所述的可高效降解柴油的细菌BHB-16在海洋柴油降解中有广泛的应用前景。本专利技术具有如下优点：1、本专利技术所述方法获得的固定化BHB-16菌的操作简单，且珊瑚石载体颗粒对微生物无任何毒副污染，珊瑚石载体颗粒可以作为安全有效的吸附载体。2、本专利技术所述的固定化BHB-16菌的方法所使用的原材料价格低廉，当珊瑚石载体颗粒完成对菌株BHB-16的固定化后，通过高温灭菌、清洗处理和煮沸，进而达到对固定化载体的回收利用，有助于资源的节约和环境的保护。3、通过本专利技术实施例的数据表明，本专利技术所述的BHB-16游离菌对柴油的降解率为52.2％，而通过本专利技术所述方法制得的固定化颗粒，具有很好的微生物活性，对柴油具有很好降解性能，降解率最高可达82.2％，相对于游离菌而言有效提高了30％。附图说明图1为菌体的接种量对载体固定化效果的影响。其中，横坐标为菌体的接种量(mL)，纵坐标为载体对菌液的吸附量(mL)。向含有12mL载体的60mL2216E液体培养基中，分别接种0.4、0.5、0.6、0.7和0.8mL处于稳定生长期的柴油降解菌BHB-16(OD600nm＝1.182～1.188)，检测不同接种量对载体固定化效果的影响。结果如图1所示，载体对菌株的固定化效果随接种量的增大呈下降的趋势，当接种量为0.4～0.5mL时，载体对BHB-16菌液的吸附量相对较多，于0.4mL时达到最大，即具有最优固定化效果。由此确定固定化过程中菌株的接种量与培养基的体积比在(0.4～0.5)mL：60mL范围内，均可以达到较好的固定化效果，当二者比例为0.4mL：60mL时，固定化效果最佳。图2为菌株的培养时间对载体固定化效果的影响。其中，横坐标为菌体对载体的吸附时间(h)，纵坐标为载体对菌液的吸附量(mL)。向含载体量为12mL的60mL2216E液体培养基中接入0.4mL处于稳定生长期的石油降解菌BHB-16(OD600nm＝1.182～1.188)，于不同温度下连续培养，并分别于培养后的24、26、28、30和32h时测定固定化载体对菌株的吸附量，进而判断其固定化效果。实验结果如图2所示，珊瑚石对菌株的固定化效率随时间的延长呈现增高后降低的趋势，当培养时间为28～30h时载体对菌株的吸附效果较好，在28h时，其吸附量达到最高。由此确定固定化过程中菌株最适的培养时间为28～30h，并且于28h时固定化效果最佳。图3为载体投加量对其固定化效果的影响。其中，横坐标为载体投加量(mL)，纵坐标为载体对菌液的吸附量(mL)。由图3可见，珊瑚石载体对于菌株的固定化效率随载体量增加均呈现先增高后降低的变化趋势。当载体投加量为10～14mL时，载体对菌株的吸附量较大，于12mL时，吸附量达到最高水平，载体固定化效果最好。由此确定，固定化过程中载体的投加量与培养基的体积比在10～14mL：60mL范围内，均可以达到较好的固定化效果，当二者比例为12mL：60mL时，固定化效果最佳。图4为固定化菌对柴油的降解效率。其中，横坐标为游离菌及固定化菌，纵坐标为二者对柴油的降解效率(％)。如图4所示，使用珊本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株可高效降解柴油的细菌，其特征在于，该菌株为BHB‑16(Lutibacterium)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.11549。

【技术特征摘要】
1.一株可高效降解柴油的细菌，其特征在于，该菌株为BHB-16(Lutibacterium)，其在
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.11549。
2.如权利要求1所述的细菌BHB-16的固定化方法，其特征在于，步骤包括：
①活化菌种BHB-16，菌浓度达OD600nm＝1.182～1.188；
②将珊瑚石载体进行清洗、煮沸和烘干后，利用排水法称量其体积；
③向步骤②所得珊瑚石载体中加入2216E液体培养基，灭菌后，再加入步骤①所得细菌
BH...

【专利技术属性】
技术研发人员：关晓燕，董颖，杨爱馥，陈仲，王摆，王召会，蒋经伟，高杉，姜冰，苏鹤声，孙红娟，姜北，周遵春，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21