一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术属于临床检验诊断学领域，涉及一种鲍曼不动杆菌快速检测试剂盒及检测方法；本发明专利技术还提供一种鲍曼不动杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包括：DNA抽提试剂、2对多重PCR扩增引物、2×PCR Mix预混液、灭菌双蒸水；所述检测方法包括：痰液标本和血液标本鲍曼不动杆菌DNA提取, 根据鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计PCR引物，采用多重PCR方法检测待测样本中多重耐药鲍曼不动杆菌和敏感菌株；本发明专利技术建立了一套简便、快速、可行的多重耐药鲍曼不动杆菌诊断方法，可以实现短时间内（4~6小时）对多重耐药鲍曼不动杆菌检测，为临床治疗争取时间，并遏制多重耐药的发生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床检验诊断学领域，涉及一种鲍曼不动杆菌快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及临床痰液标本中DNA提取和多重耐药鲍曼不动杆菌快速检测方法。
技术介绍
鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii,Ab）是不动杆菌属中最常见的一个菌种，是一种不发酵糖类、革兰染色阴性、无动力的球杆菌，普遍存在于自然界和人体。该菌在医院内分布广泛且可以长期存活，是院内感染重要的条件致病菌之一，可引起呼吸机相关性肺炎（VAP）,泌尿系统感染、菌血症、复杂的皮肤软组织感染、腹膜炎和中枢神经系统感染等。感染多见于免疫力低下的患者，特别是重症监护病房（ICU）病人。近年来在全球范围内鲍曼不动杆菌耐药性上升显著。世界各地大量报道了多重耐药鲍曼不动杆菌（multi-drug-resistanceAcinetobacterbaumannii,MDR-Ab）和泛耐药鲍曼不动杆菌（extensivedrug-resistanceAcinetobacterbaumannii,XDR-Ab）的爆发流行。MDR-Ab是指对头孢菌素、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、氨基糖苷以及β-内酰胺酶抑制剂，这五类抗生素中至少三类耐药的鲍曼不动杆菌；XDR-Ab是指对上述五类抗生素均耐药的鲍曼不动杆菌，但不包括多粘菌素和替加环素耐药；仅针对上述五类抗生素中1类或2类耐药的敏感株鲍曼不动杆菌目前临床已较少见；多/泛耐药鲍曼不动杆菌已成为卫生保健领域的重大课题和21世纪抗感染治疗领域的超级挑战。产碳青霉烯酶（oxacillin-hydrolyzing，OXA）是鲍曼不动杆菌获得对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制。碳青霉烯酶是指能够水解至少一种碳青霉烯类抗生素酶，本质上仍属于β-内酰胺酶。根据该酶的分子结构可分为A类、B类和D类。D类酶目前报道最多，按氨基酸同源性又可分为8种，在鲍曼不动杆菌中主要是4种：OXA23、OXA24、OXA51和OXA58。OXA酶编码基因多位于细菌染色体或质粒上，由整合子或转座子介导，极易在鲍曼不动杆菌之间发生平行传播。因此鲍曼不动杆菌OXA酶表达情况具有明显的地域性，我国目前报道的鲍曼不动杆菌OXA基因主要有OXA23、OXA24和OXA51（[1]许顺姬等,不动杆菌碳青霉烯酶耐药性与OXA-51基因型研究.现代预防医学[J],2015.42(5):889-891.；[2]邓德耀等,OXA-51型β内酰胺酶的研究进展.中国感染与化疗杂志[J],2014.14(5):451-454.；[3]张伟红等,耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药表型和碳青霉烯酶基因型分析.中国感染与化疗杂志[J],2011.11(1):45-48.）。我国由于临床长期经验性和广泛性使用广谱抗生素，造成近年来鲍曼不动杆菌的分离率和耐药率显著升高，并已从单一抗生素耐药发展成为多重耐药，成为医院感染的重要病原菌之一。国内通常使用亚胺培南+β-内酰胺酶抑制剂复合制剂治疗鲍曼不动杆菌感染，但目前鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药性已非常严重。对于耐亚胺培南鲍曼不动杆菌治疗则使用替加环素，该药物成本高昂且已发现鲍曼不动杆菌有耐替加环素的趋势，因此临床鲍曼不动杆菌治疗需要科学合理的选择抗生素。目前临床只能通过细菌培养和药敏实验的方法检测鲍曼不动杆菌耐药性，该方法至少需要72h，远不能适应临床治疗的要求，急需一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法（[1]李玉梅等,医院细菌分离培养及药敏试验结果分析.中国公共卫生[J],2015.31(3):383-384.；[2]张利元等,医院感染的细菌分布及药敏检测分析.中国现代医学杂志[J],2012.22(25):86-89.）。
技术实现思路
本专利技术实施提供一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法，用于解决临床快速评估鲍曼不动杆菌耐药性，并指导临床合理使用抗生素。本专利技术根据鲍曼不动杆菌OXA24（GeneBank:AJ239129.2）和OXA51（GeneBank:AJ309734.2）基因序列设计PCR引物，采用多重PCR方法检测100株鲍曼不动杆菌（其中多重耐药菌50株，敏感菌50株），经检测发现多重耐药鲍曼不动杆菌均表达OXA24基因片段和OXA51基因片段，敏感菌株仅表达OXA24基因；以此建立从临床痰液标本中提取基因组DNA的方法；通过多重PCR快速检测临床标本中鲍曼不动杆及其耐药性。其中，针对鲍曼不动杆菌OXA24基因引物序列为：Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；PCR产物预测长度为246bp。针对鲍曼不动杆菌OXA51基因引物序列为：Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；PCR产物预测长度为353bp。若电泳检测结果含有246bp（OXA24）和353bp（OXA51）两个条带则确定为含有多重耐药鲍曼不动杆菌，若电泳结果仅有246bp（OXA24）一个条带则确定为含有敏感菌株。本专利技术提供一种鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法，具体包括如下步骤：（1）基于鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计多重PCR扩增引物；（2）待检痰液标本或血液标本基因组DNA抽提；（3）使用步骤（1）所述的引物进行多重PCR技术扩增待检样本DNA；（4）对PCR结果进行电泳检测。其中，步骤（1）中所述的引物序列如前面所述的Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）、Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）、Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）和Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）所示。其中，步骤（2）中所述的血液标本基因组DNA抽提采用市售全血基因组DNA提取试剂盒即可。本专利技术还提供了步骤（2）中所述的痰液标本DNA快速提取方法，具体步骤包括：在痰液标本中加入等体积浓度为1mol/LNaOH溶液，于60℃水浴中放置10min使痰液充分液化；然后将液化后痰液离心（6000g,10min），收集沉淀用于鲍曼不动杆菌基因组DNA提取；加入20μL10mg/mL溶菌酶于37℃静置10min裂解细菌；再加入20μL20mg/mL蛋白酶K于60℃消化10min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用酚-氯仿法抽提细菌基因组DNA。其中，步骤（3）中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）基于鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计多重PCR扩增引物；（2）待检痰液标本或血液标本基因组DNA抽提；（3）使用步骤（1）所述的引物进行多重PCR技术扩增待检样本DNA；（4）对PCR结果进行电泳检测。

【技术特征摘要】
1.一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）基于鲍曼不动杆菌OXA24和OXA51基因序列设计多重PCR扩增引物；
（2）待检痰液标本或血液标本基因组DNA抽提；
（3）使用步骤（1）所述的引物进行多重PCR技术扩增待检样本DNA；
（4）对PCR结果进行电泳检测。
2.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌
为多重耐药鲍曼不动杆菌和敏感株菌，其中所述多重耐药鲍曼不动杆菌均表达OXA24基因
片段和OXA51基因片段，敏感菌株仅表达OXA24基因。
3.根据权利要求1所述的一种鲍曼不动杆菌检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述的
多重PCR扩增引物序列如下所示：
针对鲍曼不动杆菌OXA24基因引物序列为：
Ab-OXA24-F（SEQ.NO.ID.1）：5’-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3’，
Ab-OXA24-R（SEQ.NO.ID.2）：5’-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3’；
PCR产物预测长度为246bp；
针对鲍曼不动杆菌OXA51基因引物序列为：
Ab-OXA51-F（SEQ.NO.ID.3）：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’,
Ab-OXA51-R（SEQ.NO.ID.4）：5’-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3’；
PCR产物预测长度为353bp。
4.权利要求1步骤（2）中所述的痰液标本基因组DNA抽提方法，其特征在于，具体步骤
包括：在痰液标本中加入等体积NaOH溶液，于水浴中放置使痰液充分液化；然后将液化后痰
液离心，收集沉淀用于鲍曼不动杆菌基因组DNA提取；加入溶菌酶于37℃静置10min裂解细
菌；再加入蛋白酶K于60℃消化10min，进一步降低痰液标本粘稠度，最后使用酚：氯仿法抽
提细菌基因组DNA。
5.根据权利要求4所述的痰液标本基因组DNA抽提方法，其特征在于，所述NaOH溶液浓
度为1mol/L；所述水浴条件为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴亮，陈盛霞，姜旭淦，阴晴，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32