AXMI422毒素基因及其使用方法技术

在此提供了用于向细菌、植物、植物细胞、组织以及种子赋予杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包括针对毒素多肽的编码序列的组合物。这些编码序列可以用在用于在植物和细菌中转化和表达的DNA构建体或表达盒中。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。具体地说，提供了分离的毒素核酸分子。另外，涵盖了与这些多核苷酸相应的氨基酸序列、以及与这些氨基酸序列特异性结合的抗体。具体地说，本发明专利技术提供了分离的核酸分子，这些核酸分子包含对SEQ ID NO:2-3中所示的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列、或在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列、以及其变体和片段。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖的基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品中以及在生产转基因抗有害生物植物中是有用的。专利技术背景苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性产芽孢土壤细菌，其特征在于其产生晶状内含体的能力，所述晶状内含体特异性地对于昆虫的某些目和种具有毒性，但对于植物和其他非靶生物是无害的。因此，包括苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白质的组合物可用作环境上可接受的杀昆虫剂以用于控制农业昆虫有害生物或者各种人或动物疾病的昆虫媒介。来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目、半翅目、双翅目、以及鞘翅目幼虫的有效的杀昆虫活性。这些蛋白还已经显示针对膜翅目、同翅目、虱目、食毛目、以及蜱螨亚纲有害生物目(Acaripestorder)、连同其他无脊椎动物目(如线虫动物门、扁形动物门、以及原生动物门肉鞭毛虫亚门)的活性(费特逊(Feitelson)(1993)苏云金芽孢杆菌家族树(TheBacillusThuringiensisfamilytree).先进的工程杀有害生物剂(AdvancedEngineeredPesticides)，马塞尔穧德克尔格式(MarcelDekker,Inc.)，纽约，纽约州(N.Y.))。这些蛋白最初主要基于它们的杀昆虫活性而分类为CryI至CryV。这些主要的类别是鳞翅类特异的(I)、鳞翅类与双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)与(VI)。这些蛋白质进一步分类成亚家族；在每个家族内更高度相关的蛋白质被指定了分组字母例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等等。在每个分组内更加密切相关的蛋白质被给予诸如Cry1C1、Cry1C2等的名称。基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(克里克莫尔(Crickmore)等人(1998)微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)62:807-813)。在此分类中，每种毒素被指定了独特的名称，其中包括第一级(primaryrank)(阿拉伯数字)、第二级(secondaryrank)(大写字母)、第三级(tertiaryrank)(小写字母)、以及第四级(quaternaryrank)(另一个阿拉伯数字)。在第一级中，罗马数字已被换成阿拉伯数字。具有低于45％的序列一致性的蛋白质具有不同的第一级，第二和第三级的标准分别为78％和95％。晶体蛋白不展示杀昆虫活性，直至其被摄取并溶解在昆虫中肠之中。被摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(和怀特利(Whiteley)(1989)微生物学评论(Microbiol.Rev.)53:242-255)。这种毒素与靶幼虫的中肠中的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。δ-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和三个保守的结构性结构域(参见，例如戴马格德(deMaagd)等人(2001)遗传学趋势17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的三个β片层组成并且结构域III由“果冻卷”结构中的两个反向平行的β片层组成(deMaagd等人，2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。由于昆虫可能带来破坏、以及通过控制昆虫有害生物在产量方面的改进，对于发现新形式的杀有害生物毒素存在着不断的需要。专利技术概述在此提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织以及种子杀有害生物活性的组合物和方法。组合物包括针对杀有害生物的和杀昆虫的多肽的核酸分子编码序列、包括那些核酸分子的载体、以及包括这些载体的宿主细胞。组合物还包括这些杀有害生物多肽序列以及针对那些多肽的抗体。这些核苷酸序列可以用在DNA构建体或表达盒中，以用于在多种生物(包括微生物和植物)中进行转化和表达。这些核苷酸或氨基酸序列可以是合成序列，这些合成序列已经被设计为用于在一种生物中表达，该生物包括但不局限于：一种微生物或一种植物。组合物还包括含有本专利技术的核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织、以及种子。具体地说，提供了编码一种杀有害生物蛋白的分离的或重组的核酸分子。另外，涵盖了与这些杀有害生物蛋白相应的氨基酸序列。具体地，本发明提供了一种分离或重组的核酸分子，该核酸分子包括编码SEQIDNO:2-3中所示的氨基酸序列的核苷酸序列、或在SEQIDNO:1中列出的核苷酸序列、以及它们的生物活性变体和片段。还涵盖了与本专利技术的一个核苷酸序列互补的核苷酸序列、或与本专利技术的一个序列或其互补物杂交的核苷酸序列。另外还提供了包括本专利技术的核苷酸序列或者编码本专利技术的氨基酸序列的核苷酸序列以及它们的生物活性变体和片段的载体、宿主细胞、植物以及种子。提供了用于产生本专利技术的多肽的方法、以及用于使用这些多肽来控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫、或双翅目有害生物的方法。还包括用于检测在样品中的本专利技术的这些核酸和多肽的方法和试剂盒。本专利技术的这些组合物和方法用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物。这些生物以及包括这些生物的组合物对于农业目的是所希望的。本专利技术的组合物还用于产生具有杀有害生物活性的改变的或改进的蛋白、或检测在产物或生物中的杀有害生物蛋白或核酸的存在。详细说明本专利技术描绘了用于调节生物(特别是植物或植物细胞)中的有害生物抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”是指该有害生物(例如，昆虫)在摄取或以其他方式接触本专利技术的多肽类之后被杀死。“耐受性”是指该有害生物的运动、摄食、繁殖、或其他功能的损害或降低。这些方法涉及用编码本专利技术的一种杀有害生物蛋白的核苷酸序列来转化生物。具体地说，本专利技术的核苷酸序列用于制备具有杀有害生物活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织以及种子。组合物是杆菌或其他物种的杀有害生物核酸和蛋白质。这些序列用于随后转化到感兴趣的生物中的表达载体的构建，作为用于其他同源(或部分同源的)基因的分离的探针，以及用于通过本领域中已知的方法(如，结构域交换或DNA改组)来产生改变的杀有害生物蛋白，例如内毒素的Cry1、Cry2以及Cry9家族成员。这些蛋白用于控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目、以及线虫有害生物种群、以及用于生产具有杀有害生物活性的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组核酸分子，该重组核酸分子包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下各项组成：a)在SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列；b)一种核苷酸序列，其对包含SEQ ID NO:2‑3中任一项的氨基酸序列的多肽进行编码；c)一种核苷酸序列，其对包含与SEQ ID NO:2‑3中任一项的氨基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.09 US 61/863,9751.一种重组核酸分子，该重组核酸分子包括核苷酸序列，该核苷酸序
列编码具有杀有害生物活性的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，
该组由以下各项组成：
a)在SEQIDNO:1中列出的核苷酸序列；
b)一种核苷酸序列，其对包含SEQIDNO:2-3中任一项的氨基
酸序列的多肽进行编码；
c)一种核苷酸序列，其对包含与SEQIDNO:2-3中任一项的氨
基酸序列具有至少95％序列一致性的氨基酸序列的多肽进行编码。
2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已经被
设计为用于在植物中表达的合成序列。
3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列被可操作
地连接至启动子，该启动子能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达。
4.一种包括如权利要求1所述的重组核酸分子的载体。
5.如权利要求4所述的载体，该载体进一步包括编码异源多肽的核酸
分子。
6.一种包括如权利要求1所述的重组核酸的宿主细胞。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是细菌宿主细胞。
8.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是植物细胞。
9.一种包括如权利要求8所述的宿主细胞的转基因植物。
10.如权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物选自下组，该组由
以下各项组成：玉米、高粱、小麦、甘蓝、向日葵、番茄、十字花科植物、
胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、以及油菜。
11.一种包括如权利要求1所述的核酸分子的转基因种子。
12.一种具有杀有害生物活性的重组多肽，该多肽选自下组，该组由以
下各项组成：
a)一种包括SEQIDNO:2-3中任一项的氨基酸序列的多肽；以
及
b)一种包括与SEQIDNO:2-3中任一项的氨基酸序列具有至少
95％序列一致性的氨基酸序列的多肽。
13.如权利要求12所述的多肽，该多肽进一步包括异源氨基酸序列。
14.一种包括如权利要求12所述的多肽的组合物。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物选自下组，该组由
以下各项组成：粉末、尘剂、小丸、颗粒、喷雾剂、乳液、胶体、以及溶
液。
16.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物是通过将细菌细胞
的培养物进行脱水、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降、或浓缩而制
备的。
17.如权利要求14所述的组合物，该组合物包含按重量计从大约1％至
大约99％的所述多肽。
18.一种用...

【专利技术属性】
技术研发人员：K罗伯茨，KS桑普森，D莱蒂南，L马加尔黑斯，
申请(专利权)人：阿则耐克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国;US