检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人类表皮生长因子受体(EGFR)基因和/或K-ras基因的引物、探针，包含该引物和探针的试剂盒，以及一种基于数字PCR平台检测基因突变的装置。使用本发明专利技术的引物和探针检测基因突变的方法包括：提供所述引物及探针；提取待测样品的DNA；配制扩增突变基因序列的荧光PCR反应体系；用目标探针与内参探针分别与扩增产物杂交，并检测相应荧光基团的荧光信号；根据目标探针与内参探针的荧光信号的强度和比例，判断基因突变的存在和/或计算突变率。本发明专利技术的检测基因突变的方法所需引物及探针数量少，优化过程简单，可以定性或定量地检测EGFR和/或K-ras基因的相关突变，且检测灵敏度高；对低起始量的DNA样本，也能够稳定检出。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因突变检测领域，具体地，涉及检测人类表皮生长因子受体(EGFR)基因和/或K-ras基因的突变的引物、探针，包含该引物和探针的试剂盒以及一种基于数字PCR平台检测基因突变的装置。
技术介绍
根据国际癌症研究中心(IARC)估计，未来癌症发病人数年均将会以3％～5％的速度递增，预计2020年全球将有2000万新发病例，死亡病例将达1200万。从发病率来看，中低收入国家癌症发病率远高于发达国家。所以强调各国应当采取必要的预防措施。我国每年用于癌症病人的医疗费用约800亿元，约占卫生总支出的20％，远高于其他慢性病的医疗费用。近50年来，我国癌症的发生谱有明显的变化：原来高发的胃癌、宫颈癌、阴茎癌、食管癌和鼻咽癌等有不同程度的下降；而肺癌、乳癌、结肠癌和前列腺癌等发病率有明显上升。肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病，癌症相关基因异常是导致肿瘤细胞出现逃避凋亡、无限复制、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等异常生物学行为的根本原因。靶向治疗，是针对肿瘤细胞特有的靶点(如导致肿瘤细胞生长失控的基因靶点)设计结合药物，达到抑制肿瘤细胞分裂增殖。具有高选择性和低毒性，可以长期用药，从而可以在延长患者生存时间的同时改善生活质量。21世纪以来，在临床肿瘤学领域内，分子靶向治疗(MolecularTargetedTherapy)的涌现已经为很多乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、大肠癌、肾癌、白血病和胃肠间质瘤(GIST)等患者带来了生存希望。在短短的十数年间，先后涌现出针对肿瘤细胞增殖信号传导通路的利托昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(贺赛汀)、吉非替尼(易瑞沙)、厄罗替尼(特罗凯)、伊马替尼和西妥昔单抗(爱必妥)以及针对肿瘤新血管生成的贝伐单抗(Avastin)、恩度(rh血管内皮抑素，endostar)等一大批分子靶向药物。索拉非尼是第一个获得FDA批准用于治疗晚期肾癌的药物，可使晚期肾癌患者的无进展生存期(PFS)延长一倍；替西罗莫司(temsirolimus)2007年经美国FDA批准用于晚期肾癌的治疗，2009年NCCN肾癌专家组将替西罗莫司作为高危转移性肾透明癌患者的一线治疗方案。口服的mTOR抑制剂依维莫司(everolimus)则在2010年经FDA批准上市。近年来，以表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)和EGFR信号通路中关键的组分为靶标的分子靶标检测及靶向治疗成为国际肿瘤界个体化医疗关注的焦点。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，吉非替尼和厄罗替尼已被FDA批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。这些靶向药物已应用于晚期和不适宜传统治疗方案的NSCLC患者的临床治疗。此外，范得他尼(Zactima)和索拉菲尼也都在进行临床试验，初步结果令人鼓舞。EGFR主要位于细胞膜上，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增值、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR信号转导通路上的基因发生体细胞突变及表达异常，从而导致肿瘤细胞无限制的扩增和迁移。美国国家癌症综合网络(NCCN)2009年版的临床指南中明确指出：EGFR突变，尤其是第19号外显子缺失突变与肿瘤对TKIs如吉非替尼(Gefitinib)的敏感度有重要关系。综合文献中大量数据显示，Gefitinib在携带EGFR基因突变的NSCLC中的有效率是76.7％，有的文献提到的有效率甚至达到90％以上，而在野生型EGFR患者中只有12.2％。EGFR突变是靶向药物治疗的一个必要前提条件。K-ras基因编码21kD的RAS蛋白，又名p21基因。在ras基因中，K-ras对人类癌症影响最大，它是一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。检测K-ras基因突变是深入了解癌基因的情况，了解各种癌症的发展预后，放、化疗疗效的重要指标。针对非小细胞肺癌的统计显示，约25％的腺癌患者携带K-ras基因突变。K-ras变异与吸烟史相关，与K-ras野生型患者相比，突变携带者具有更短的生存时间，与患者的不良预后相关。临床研究显示，具有K-ras基因突变的NSCLC患者对EGFR-TKI治疗不敏感。美国国家癌症综合治疗联盟(NationalComprehensiveCancerNetwork，NCCN)《结直肠癌临床实践指南》明确指出：1)所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；2)只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗。因此，检测组织或血浆中EGFR、K-ras基因突变对于癌症患者临床用药，具有重要的参考价值。EGFR基因突变主要发生在第18-21号外显子，最常见的突变包括第19号外显子的缺失突变，第20号外显子的片段插入和第21号外显子的点突变，这三类突变占EGFR突变的90％以上。第19号外显子的碱基缺失主要是在第746-752位密码子的缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失，从而改变了细胞对TKIs的敏感性；第20号外显子第790位密码子(核甘酸位置2669碱基替换)出现T-M转换突变是引起耐药的主要原因；第21号外显子的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。K-ras基因的突变80％-90％主要位于K-ras基因的第2号外显子的密码子12位和13位上，包括7种突变类型：G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C。目前的突变检测方法包括：Sanger测序法、实时荧光定量PCR法、高通量测序方法等。Sanger测序法，即Sanger(桑格)双脱氧链终止法，是通过聚合酶链式反应(PCR)加毛细管电泳分离，再对PCR产物最末端碱基所带的荧光信号进行分析，计算机自动分析得出位置及碱基，最终得到序列的方法。该方法步骤繁琐，试验周期长(一般需2-3天)，对操作人员技术水平要求高，因此难以在临床大面积推广。更为重要的是测序技术本身灵敏度不高，只能检测15％以上的突变。而肿瘤组织是一个异质性的组织，EGFR突变又是一种杂合性突变，即EGFR基因DNA双链中有本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测人类EGFR基因第18‑21号外显子突变的引物及探针，包括以下四组引物和探针或与其具有至少60％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性的核苷酸序列：(1)用于检测EGFR基因第18号外显子突变的引物及探针：上游引物SEQ ID NO:1：5’‑CCTTGTCTCTGTGTTCTTGT‑3’；下游引物SEQ ID NO:2：5’‑TGTGCCAGGGACCTTAC‑3’；目标探针SEQ ID NO:3：5’‑CCGGAGCCCAGCTCTTTGATCT‑3’；(2)用于检测EGFR基因第19号外显子突变的引物及探针：上游引物SEQ ID NO:5：5’‑TAAAATTCCCGTCGCTATCAA‑3’；下游引物SEQ ID NO:6：5’‑AAAGGTGGGCCTGAGGTTCA‑3’；目标探针SEQ ID NO:7：5’‑GTTCAGAGCCATGGACCC‑3’；(3)用于检测EGFR基因第20号外显子突变的引物及探针：上游引物SEQ ID NO:9：5’‑AGGCAGCCGAAGGGCA‑3’；下游引物SEQ ID NO:10：5’‑CCTCACCTCCACCGTGCA‑3’；突变型探针SEQ ID NO:11：5’‑TGAGCCGCGTGATGA‑3’；野生型探针SEQ ID NO:12：5’‑TGAGCCGCATGATGA‑3’；(4)用于检测EGFR基因第21号外显子突变的引物及探针：上游引物SEQ ID NO:13：5’‑AACACCGCAGCATGTCAAGA‑3’；下游引物SEQ ID NO:14：5’‑TTCTCTTCCGCACCCAGC‑3’；突变型探针SEQ ID NO:15：5’‑TTGGGCGGGCCAAACTGCTG‑3’；野生型探针SEQ ID NO:16：5’‑TTGGGCTGGCCAAACTGCTG‑3’。...

【技术特征摘要】
1.用于检测人类EGFR基因第18-21号外显子突变的引物及探针，包括以下四组
引物和探针或与其具有至少60％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一
性的核苷酸序列：
(1)用于检测EGFR基因第18号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:1：5’-CCTTGTCTCTGTGTTCTTGT-3’；
下游引物SEQIDNO:2：5’-TGTGCCAGGGACCTTAC-3’；
目标探针SEQIDNO:3：5’-CCGGAGCCCAGCTCTTTGATCT-3’；
(2)用于检测EGFR基因第19号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:5：5’-TAAAATTCCCGTCGCTATCAA-3’；
下游引物SEQIDNO:6：5’-AAAGGTGGGCCTGAGGTTCA-3’；
目标探针SEQIDNO:7：5’-GTTCAGAGCCATGGACCC-3’；
(3)用于检测EGFR基因第20号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:9：5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’；
下游引物SEQIDNO:10：5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’；
突变型探针SEQIDNO:11：5’-TGAGCCGCGTGATGA-3’；
野生型探针SEQIDNO:12：5’-TGAGCCGCATGATGA-3’；
(4)用于检测EGFR基因第21号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:13：5’-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3’；
下游引物SEQIDNO:14：5’-TTCTCTTCCGCACCCAGC-3’；
突变型探针SEQIDNO:15：5’-TTGGGCGGGCCAAACTGCTG-3’；
野生型探针SEQIDNO:16：5’-TTGGGCTGGCCAAACTGCTG-3’。
2.根据权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，针对第(1)组引物及目标

\t探针，使用序列如SEQIDNO:4：5’-CAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCC-3’所示的寡
核苷酸为内参探针；
优选地，针对第(2)组引物及目标探针，使用序列如SEQIDNO:8：
5’-AGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG-3’所示的寡核苷酸为内参探针。
3.根据权利要求1或2所述的引物及探针，其特征在于，所述第18外显子突变
为c.2156G>C或c.2155G>A替换突变；
优选地，所述第19外显子突变为在c.2235-2253之间出现的任一缺失/插入/替换
突变；
优选地，所述第20外显子突变为c.2369C>T替换突变；
优选地，所述第21外显子突变为c.2573TG>GT、c.2573T>G或c.2582T>A替换
突变。
4.根据权利要求2-3任一项所述的引物及探针，其特征在于，所有探针均带有荧
光基团和淬灭基团，所述目标探针与所述内参探针、所述野生型探针与所述突变型探
针的荧光基团不同；
优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5和Cy3；
优选地，所述淬灭基团选自BQH1、MGB、TAMARA和BHQ2。
5.用于检测K-ras基因突变的引物及探针，包括以下引物和探针或与其具有至少
60％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性的核苷酸序列：
上游引物SEQIDNO:17：5’-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’；
下游引物SEQIDNO:18：5’-AATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC-3’；
目标探针SEQIDNO:19：5’-TGCCTACGCCTCCAGCTCC-3’。
6.根据权利要求5所述的引物及探针，其特征在于，其使用序列如SEQIDNO:20：

\t5’-TAGCTGTATCGTCAAGGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵艳敏，易吉，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44