一种采用壳聚糖吸附法制备高纯度藻红蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种操作简便、成本低廉且易于大规模工厂化生产，从紫球藻中制备高纯度藻红蛋白的方法。本发明专利技术采用的壳聚糖吸附法制备高纯度藻红蛋白的方法，与传统技术相比省去了柱层析的步骤，操作方法简便易行，成本低廉，回收率高，纯度高，并且经过了实验室放大设备的验证。采用本发明专利技术方法得到的藻红蛋白纯度A545/A280>4.0，达到了分析级要求，为藻红蛋白应用于生物医学分析和免疫化学等领域奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于海洋生物活性物质制备
，具体的说是涉及一种采用壳聚糖吸附法制备紫球藻藻红蛋白的方法。
技术介绍
紫球藻(Porphyridiumcruentum)属于红藻门单细胞藻类，可以生产多种生物活性物质如：藻胆蛋白、多不饱和脂肪酸及胞外多糖等。其中所含的藻红蛋白是一类捕光色素蛋白。它是由脱辅基蛋白和色基组成，其脱辅基蛋白是一类寡聚蛋白，开环的四吡咯藻红素作为色基部分，由于色基的存在，藻红蛋白在可见光区480～570nm处有较强的光吸收，并且具有强烈的荧光。藻红蛋白用途非常广泛，它既可以作为天然色素应用于食品、化妆品等行业，还可制成荧光试剂，用于生物医学分析和免疫化学等领域。藻红蛋白也是一种重要的生理活性物质，具有抗肿瘤，抗病毒，增强免疫力等，它还是一种具有开发潜力的光敏剂，可制成光敏剂应用于肿瘤光动力学治疗。藻红蛋白的纯度通常用(A545/A280)来表示，等级划分为0.7<食品级<3.0<反应级<4.0<分析级，藻红蛋白的纯度越高，价格越高。国外很多家公司已经投资开发藻红蛋白，产品售价甚至达到了每毫克100美元以上。但国内对其研究比较少，目前国内使用的同类产品，全部依赖于进口，其高成本已成为藻红蛋白在工业及医药范畴大量使用的限制要素，因此开发此类新型海洋产品十分重要。目前人们主要采用硫酸按分级沉淀、羟基磷灰石柱层析、凝胶过滤层析等相结合的方法制备藻红蛋白，现有的制备工艺流程存在操作复杂，生产成本高，产品质量不稳定，且难以实现工业化的大规模的生产。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供一种操作简便、成本低廉且易于大规模工厂化生产，从紫球藻中制备高纯度藻红蛋白的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的制备方案为：(1)离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例充分混匀，得细胞悬液；(2)将步骤(1)所得细胞悬液反复冻融5～7次，得到破壁液；将破壁液按照10000r/min冷冻离心10min,收集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液中逐滴加入壳聚糖溶液，至混合溶液中的壳聚糖质量浓度为0.2％～1.5％，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；向沉淀中加入含0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；接着向沉淀中加入含0.3mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取上清液；(4)室温下将步骤(3)所得上清液超滤，然后收集滤液，并将滤液冷冻干燥，即得到纯化的藻红蛋白；其中，所述步骤(1)和步骤(3)中用的磷酸盐缓冲液为pH值为6.8～7.0，浓度为0.01～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；所述步骤(3)中所用的壳聚糖溶液pH值为4.5～5.0，浓度为0.03g/ml。优选，所述步骤(4)中超滤所用膜包为分子截留量为50～60kD的膜包；进一步，超滤次数为4～6次。本专利技术的有益效果：本专利技术采用的壳聚糖吸附法制备高纯度藻红蛋白的方法，与传统技术相比省去了柱层析的步骤，操作方法简便易行，成本低廉，回收率高，纯度高，并且经过了实验室放大设备的验证。采用本专利技术方法得到的藻红蛋白纯度A545/A280>4.0，达到了分析级要求，为藻红蛋白应用于生物医学分析和免疫化学等领域奠定了基础。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的纯化后藻红蛋白的全波长扫描图。图2为本专利技术实施例1提供的纯化后藻红蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中图2中，1为标准蛋白，2为纯化的藻红蛋白。具体实施方式根据以上技术方案，首先制备壳聚糖溶液，准确称取3g壳聚糖，加入80ml水，再加入1mol/L的醋酸调节pH至4.5～5.0，加蒸馏水定容至100ml，然后放在磁力加热搅拌器使其溶解至澄清透明，从而制备出实施例1和实施例2所用浓度为0.03g/ml的壳聚糖溶液。实施例1(1)离心收集新鲜培养的紫球藻10g，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5比例混合，得细胞悬液；(2)将步骤(1)得到的细胞悬液反复冻融5次得到破壁液；将破壁液按照10000r/min冷冻离心10min，收集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液中逐滴加入壳聚糖溶液至壳聚糖质量浓度为0.5％，充分混匀，按照10000r/min冷冻离心10min，然后取沉淀；向沉淀中加入含0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；接着向沉淀中加入含0.3mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取上清液；取少量样品测定吸光度A545和A280，藻红蛋白纯度(A545/A280)＝4.1；(4)室温下将上清液经分子截留量为50kD膜包超滤，超滤4次，收集滤液，将滤液冷冻干燥后得到纯化的藻红蛋白；其中，步骤(1)和步骤(3)中用的磷酸盐缓冲液的pH为6.8，浓度为0.01mol/L。取少量样品进行全波长扫描和电泳分析，结果见图1、图2，制备的藻红蛋白最大吸收峰为545nm，纯度(A545/A280)>4.0，达到了分析级要求，经纯化后的藻红蛋白在SDS-PAGE图谱中特异条带明显；实例中藻红蛋白的回收率为40.9％。实施例2(1)离心收集新鲜培养的紫球藻30g，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:8比例混合，得细胞悬液；(2)将步骤(1)得到的细胞悬液反复冻融6次得到破壁液；将破壁液按照10000r/min冷冻离心10min，收集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液中逐滴加入壳聚糖溶液至壳聚糖质量浓度为0.3％，充分混匀，按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；向沉淀中加入含0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀，接着向沉淀中加入含0.3mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取上清液；(4)室温下将上清液经分子截留量为60kD膜包超滤，超滤5次，收集滤液，将滤液冷冻干燥后得到纯化的藻红蛋白；其中，步骤(1)和步骤(3)中用的磷酸盐缓冲液的pH为6.8，浓度为0.02mol/L。该实施例中制备的藻红蛋白纯度(A545/A280)>4.0，回收率为42.7％。以上详细描述了本专利技术的优选实施方式，但是，本专利技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本专利技术的技术构思范围内，可以对本专利技术的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本专利技术的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本专利技术对各种可能的组合方式不再另行说明。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从紫球藻中制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于以下步骤，(1)离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例充分混匀，得细胞悬液；(2)将步骤(1)所得细胞悬液反复冻融5～7次，得到破壁液；将破壁液按照10000r/min冷冻离心10min,收集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液中逐滴加入壳聚糖溶液，至混合溶液中的壳聚糖质量浓度为0.2％～1.5％，然后充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；向沉淀中加入含0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；接着向沉淀中加入含0.3mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取上清液；(4)室温下将步骤(3)所得上清液超滤，然后收集滤液，并将滤液冷冻干燥，即得到纯化的藻红蛋白；其中，所述步骤(1)和步骤(3)中用的磷酸盐缓冲液为pH为6.8～7.0，浓度为0.01～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液；所述步骤(3)中所用的壳聚糖溶液为pH值为4.5～5.0，浓度为0.03g/ml的壳聚糖溶液。

【技术特征摘要】
1.一种从紫球藻中制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于以下步骤，(1)离心收集新鲜培养的紫球藻，将藻泥与磷酸盐缓冲液按1:5～1:10比例充分混匀，得细胞悬液；(2)将步骤(1)所得细胞悬液反复冻融5～7次，得到破壁液；将破壁液按照10000r/min冷冻离心10min,收集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液中逐滴加入壳聚糖溶液，至混合溶液中的壳聚糖质量浓度为0.2％～1.5％，然后充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；向沉淀中加入含0.1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，充分混匀后按照10000r/min冷冻离心10min，取沉淀；接着向沉淀中加入含0.3mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐志红，徐静，孙利芹，任育红，王晓倩，丁珂，季昱含，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：山东;37