一种中药炮制机理研究方法技术

一种中药炮制机理研究方法，该方法针对中药炮制机理研究的关键问题，建立一种以中药炮制后吸收入血的化学成分为研究目标，通过血清药物化学研究和计算机虚拟筛选技术对中药炮制品的吸收入血成分进行指认及在线解析，并结合模糊数学方法研究入血成分的君、臣、佐、使关系；比较中药炮制前后入血成分及其含量的变化，进而从入血成分变化的角度阐明中药炮制机理。该发明专利技术较之以往的中药炮制机理研究，结果更加直观，从直接发挥临床作用的入血成分变化的角度进行研究，进而阐明其炮制前后药效物质基础的变化，从而揭示其炮制的机理。此发明专利技术从新的视角阐述传统中药炮制机理，为使中药炮制品质量的稳定和可控提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中药
，涉及一种用于中药炮制机理研究的新方法。技术背景1、中药炮制后入药，是中医用药的传统和特色。中药炮制品历经数千年的临床应用，已经证实其炮制的有效性及必要性。中药炮制后药理活性的变化，根本是基于其药效成分发生了改变，因此探讨药效成分的变化是中药炮制机理研究的关键；目前研究中药中药效成分的主要方法为药理活性追踪结合成分分离法，可以初步阐明中药的化学成分，但这些炮制后发生变化的成分是否为真正的药效成分，即是否能被机体吸收利用尚不明确，因此仅从中药中所含的化学成分变化的角度很难深入的阐明其炮制机理。2、研究表明：药物口服后，需经过机体的吸收转化入血而发挥临床作用。入血成分可能是中药体外的原形成分，也可能是代谢产物；因此对入血成分进行研究是探索炮制前后活性变化的有效途径；中药炮制后其药理活性的改变，可能是由其进入血液的化学成分变化导致的，所以，通过对中药炮制前后入血成分变化的研究，可从更深层次揭示中药炮制的机理。3、中药的入血成分对其疗效的贡献有主要、次要、辅助等之分，即也具有类似中医方剂中的“君、臣、佐、使”相互作用关系，但由于其含量微弱因此使用常规的药理学方法很难探讨其相互作用关系。经研究发现，采用计算机虚拟筛选技术结合模糊数学方法，可对中药吸收代谢入血化学成分的君、臣、佐、使相互关系进行研究，并可结合现代检测技术对中药炮制前后吸收代谢入血成分之间的关系、含量变化等进行分析，从更深层次阐明中药炮制机理。
技术实现思路
为解决现有中药炮制机理研究的不足，本专利技术提供一种有效的研究方法。一种中药炮制机理研究的新方法，其研究步骤为：1对炮制后中药进行最佳给药剂量、最佳采血时间的研究。采用最佳给药剂量给药，在最佳采血时间采血，含药血清经高速离心机处理后，采用甲醇、乙腈混合液沉淀蛋白或固相萃取柱等方法处理含药血清，处理后含药血清与标准品经液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，获取中药炮制品的入血谱图。在空白血清中加入标准品，进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，并与中药炮制品的入血成分谱图进行比较，指认原形入血成分。对非原形入血的成分，采用精确质量四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF)进行在线解析，辨析代谢入血成分。2对明确的吸收代谢入血化学成分构建三维立体结构。3确定与炮制后药理作用变化直接相关的多个靶蛋白，并构建其三维立体结构。4将入血化学成分的三维结构与靶蛋白的三维结构进行计算机虚拟筛选，并利用模糊数学进行打分，确定吸收代谢入血成分的君、臣、佐、使关系。5中药炮制前的生品，采用炮制品的折合剂量给药，在最佳时间采血，含药血清采用相同的方法进行前处理，并获取其入血谱图，并与炮制品谱图的君、臣、佐、使各指纹峰进行比较，从君、臣、佐、使入血成分及其含量的变化视角阐明中药炮制的机理。本专利技术的有益效果：提供了一种从具有君、臣、佐、使相互作用的入血成分含量变化的视角进行中药炮制机理研究的方法，此方法能从更深层次阐明中药的炮制机理，为进一步完善中药炮制的质量控制提供更真实的质控标准，切实提高中药炮制品的临床疗效。具体实施方式以下对本专利技术作进一步说明。本专利技术是以明确君、臣、佐、使关系的中药炮制品入血成分为参照目标，比较中药炮制前后君、臣、佐、使入血成分质和量的变化，从而阐明中药的炮制机理。1最佳给药剂量和最佳采血时间的确定：中药炮制品采用人体给药折合计量的5、10、20、30倍给药，确定最佳给药剂量；在给药后60、90、120、180分钟，采血，确定最佳给药时间。2中药炮制品入血成分谱的获取：将中药炮制品含药血清样品进入液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，以出峰间隔为考察指标，合理选择色谱柱、检测器、色谱流动相及流速；质谱的氮气流量、CDL温度、检测器电压、内标的选择等条件。通过检测色谱峰的质谱图,从总体上分析血浆中的化学成分的离子信息。通过保留时间(tR)比对及离子碎片质荷比(m/z)解析,获取中药炮制品血清的色谱图。3中药炮制品入血成分的辨析：在空白血清中加入标准品进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，并与中药炮制品的含药血清谱图进行比较，指认原形入血成分；对代谢入血成分精确质量四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF)进行在线解析。4中药炮制品入血成分君、臣、佐、使关系：选取与中药炮制药效改变直接相关的多种靶蛋白，并构建其三维立体结构，并于中药炮制品入血成分的三维立体结构进行计算机虚拟筛选，对筛选结果进行模糊数学分析，确定中药炮制品吸收代谢入血成分的君、臣、佐、使关系。5中药炮制前的生品，采用炮制后的折合剂量给药，在最佳时间采血，采用相同的方法进行前处理，并获取其入血谱图，并与炮制品谱图的君、臣、佐、使各指纹峰进行比较，从君、臣、佐、使吸收代谢入血成分及其含量变化的视角阐明中药炮制的机理。实施例1：本专利技术采取如下研究步骤：1按照《中国药典》对中药进行炮制，精确称取中药炮制品用75%乙醇按料液比1:8提取2--4小时，减压蒸发至1ml相当于6g中药炮制品。2最佳采血时间的确定：取SD大鼠12只（180-220g），随机分组，每组6只，分成2组，其中1组为空白对照组，按照实验组剂量给予等量蒸馏水1mL，实验组6只SD大鼠以30g生药每千克体重的剂量给药，于给药后30、60、90分钟后分别从眼静脉丛取血，每组混合后，3000转/分钟离心10分钟，取上清液1mL经过经活化的固相萃取柱SPE柱中用1mL水洗脱，1mL甲醇洗脱，37度水浴以氮气吹干；使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，结果表明，末次给药后120分钟为最佳采血时间；在此时间获取中药炮制品的入血成分谱，并于空白血清比较，确定入血成分。3入血成分的解析：在空白血清中加入从中药中分离获得标准品，入液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，并与中药炮制品的入血成分谱比较，确定体外原形入血成分并构建其三维立体结构。4受体靶蛋白的选取：中药炮制后其选取与其功能改变相关的靶蛋白并构建三维立体结构。5入血成分相互作用关系：将入血成分的三维立体结构与受体靶蛋白进行DOCK分子对接，并打分，对打分结果进行模糊数学分析，确定入血成分的君、臣、佐、使关系。6中药生品入血成分谱的获取：用中药炮制品的折合剂量给药，在最佳时间采血，采用相同的条件将中药的含药血清入液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析，获取中药生品的入血成分谱。7中药炮制机理：将中药生品的入血成分谱与炮制品谱图的君、臣、佐、使各指纹峰进行比较，从君、臣、佐、使吸收代谢入血成分及其含量变化的视角阐明中药炮制的机理。实施例2：本专利技术采取如下研究步骤：1按照《中国药典》对中药进行炮制，精确称取中药炮制品用75%乙醇按料液比1:8提取2--4小时，减压蒸发至1ml相当于6g中药炮制品。2最佳采血时间的确定：取SD大鼠12只（180-220g），随机分组，每组6只，分成2组，其中1组为空白对照组，按照实验组剂量给予等量蒸馏水1mL，实验组6只SD大鼠以30g生药每千克体重的剂量给药，于给药后30、60、90分钟后分别从眼静脉丛取血，每组混合后，3000转/分钟离心10分钟，取上清液1mL采用1:1的甲醇、乙腈混合液沉淀蛋白后，15000转/分钟离心10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中药炮制机理研究方法，其特征在于包括下列步骤：1）、通过血清药物化学的研究方法，将中药炮制品以最佳给药剂量给药，在最佳采血时间采血，含药血清经高速离心后采用甲醇、乙腈混合液沉淀蛋白或固相萃取柱方法处理含药血清；2）、处理后含药血清与标准品经液相色谱串联质谱LC‑MS/MS分析比较，并结合精确质量四极杆‑飞行时间串联质谱Q‑TOF辨析炮制后中药的入血成分；3）、构建炮制后中药入血化学成分的三维立体结构，与中药炮制后药理作用变化直接相关的多个靶蛋白进行计算机虚拟筛选，结合模糊数学分析，确定炮制后中药入血成分的君、臣、佐、使关系；4）、通过炮制前后中药入血成分的君、臣、佐、使各成分相互关系及其含量变化情况阐明其炮制机理。

【技术特征摘要】
1.一种中药炮制机理研究方法，其特征在于包括下列步骤：1）、通过血清药物化学的研究方法，将中药炮制品以最佳给药剂量给药，在最佳采血时间采血，含药血清经高速离心后采用甲醇、乙腈混合液沉淀蛋白或固相萃取柱方法处理含药血清；2）、处理后含药血清与标准品经液相色谱串联质谱LC-MS/MS分析比较，并结合精确质量四极杆-飞行时间串联质谱Q-TOF辨析炮制后中药的入血成分；3）、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘可越，刘海军，
申请(专利权)人：九江学院，
类型：发明
国别省市：江西;36