CA215检测试剂盒及其制备方法和使用方法技术

本发明专利技术公开一种CA215检测试剂盒及其制备方法和使用方法。所述CA215检测试剂盒包括磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液及校准品；所述磁分离剂为包被CA215抗体的磁微粒溶液；所述化学发光底物液为二乙醇胺缓冲液，所述二乙醇胺缓冲液包含AMPPD；所述校准品采用CA215纯品配制，其标示浓度分别为0Aμ/ml、5Aμ/ml、10Aμ/ml、20Aμ/ml、50Aμ/ml、100Aμ/ml。本发明专利技术提供的CA215检测试剂盒具有灵敏度高、线性范围宽、特异性高和稳定性能好的优点，在临床上具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及属于癌症体外临床检测
，尤其涉及CA215检测试剂盒及其制备方法和使用方法。
技术介绍
近半个世纪以来，肿瘤的发病率和死亡率逐年升高，成为医学界热点中的热点。20世纪70年代，美国提出的向“肿瘤进军”反映了社会对肿瘤死亡率居高不下的焦虑，同时，在过去的几十年中，肿瘤标志在技术上和定义上有了突破，这一切都促使了肿瘤标志研究的快速发展。CA215是肿瘤相关抗原，该抗原是1987年对从培养的卵巢癌细胞提取的单克隆抗体RP215发现的。RP215被证明与位于主要由大多数癌细胞中表达的免疫球蛋白重链(一般称为CA215)碳水化合物相关的表位发生反应。由于CA215是高度与癌细胞或癌组织相关联的，且一般不能在正常人组织中发现，除了在增生上皮细胞或组织，例如皮肤、食道、子宫颈以及几个免疫特殊部位，包括神经，眼睛和睾丸。CA215作为一个泛癌生物标志物的具有潜在应用价值，并且可以与其它已知的癌症生物标志物的并行比较来记录CA215的在人类许多不同类型的癌症的免疫诊断的临床应用。发现癌症患者和正常人血清CA215水平是显著差异(P<0.001)。由于临床分期，在卵巢癌的情况下，相比正常个体其阳性率范围从58-86％不等。对于宫颈癌患者，在癌症晚期的阶段阳性率分别高达66-94％。宫颈癌和卵巢癌这些临床研究的结果还表明，平均血清CA215水平在术前阶段并在一周外科手术或化疗或放疗之前之内维持在相当高的水平。相反，当手术操作或化疗或放疗七天后测定，血清CA215水平显著下降。基于这些研究，可以得出结论认为，癌症患者的子宫颈和卵巢癌之间的手术切除或化学治疗导致在CA215水平在统计学上显著减少。结果表明，CA215在癌症患者中最可能从肿瘤部位产生，且该肿瘤负荷可由癌症患者的血清CA215水平充分地反映检测到。因此，癌症患者的血清CA215水平的例行检测对监测癌症发展的计划之后治疗或手术治疗的状态是有益的。作为一个泛癌标志物，CA215比癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)或β2微球蛋白更好，在大多数癌症中具有更高的显示阳性检出率。对于大多数人类癌症CA215阳性检出率都比较高，包括卵巢癌。然而，在子宫颈癌的情况下，使用CA215组合检测比单独用CA125有更高的检出率，检出率从13％提升至81％。然而，对于卵巢癌用CA215和CA125的组合也有更好的检出率，检测率从59％提升至82％。对于肺癌，CA215和CYFRA21-1组合检测也具有较好的阳性检出率。对于肝癌，CEA或甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)与CA215的组合似乎有更高的阳性检出率。总之，其他癌症生物标志物与CA215的组合可以提高在常规临床诊断癌症中的阳性检出率。上世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)和酶免疫((enzymeimmunoassay，EIA)相似，不同这处是以发光物质作为底物，并借助其自身的发光强度直接进行测定。在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)。化学发光分析系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
技术实现思路
本专利技术提供一种CA215检测试剂盒，可以定量检测人类癌症标志物CA215的浓度，具有灵敏度高、线性范围宽、非特异性低和稳定性能好的优点。本专利技术提供的CA215检测试剂盒包括磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液以及校准品；其中，所述磁分离剂为包被CA215抗体的磁微粒溶液；所述化学发光底物液为二乙醇胺缓冲液，所述二乙醇胺缓冲液包含3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐；所述校准品采用CA215纯品配制，其标示浓度分别为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml、100AU/ml。优选的，所述磁分离剂按照以下方法制备：(1)活化磁微粒：取充分混匀后的羧基磁微粒放于离心管中，将离心管放置于磁分离架上，待羧基磁微粒完全被吸附分离后，去除上清液，加入MES缓冲液洗涤羧基磁微粒至少一次；再加入EDC溶液和NHS溶液将羧基磁微粒活化；(2)包被磁微粒：用MES缓冲液洗涤活化后的羧基磁微粒至少一次，将离心管置于磁分离架上，分离去除上清液，加入2.5mg/ml的CA215抗体混匀，在室温下反应2～4小时，反应结束后，再将离心管置于磁分离架上，去除上清液，用乙醇胺溶液洗涤至少一次，然后再加入乙醇胺溶液于离心管中，室温反应2～4小时，反应结束后，去除上清液保存，其中，羧基磁微粒与CA215抗体的体积比为1：1；(3)采用磁珠悬浮液液将步骤(2)制备的包被磁微粒稀释至0.1～1mg/ml。优选的，所述羧基磁微粒为Fe3O4/Fe2O3磁性纳米粒子和有机高分子材料的聚合物，其平均粒径为0.5～5μm，优选1～3μm，且所述羧基磁微粒表面带有羧基、氨基和羟基中的一种或多种基团。优选的，上述磁珠悬浮液按照以下方法配制：称取Tris-碱1.21g、氯化钠4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的纯化水，混匀后静置10min后用盐酸或氢氧化钠调节PH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明胶、1mol/L的氯化镁0.5ml、1mol/L的氯化锌0.05ml、1mol/L的氯化钙0.1ml和0.5mL的T-20，用纯化水定容到500mL，过滤得到磁珠悬浮液。优选的，所述示踪物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯中的至少一种，优选碱性磷酸酶。优选的，所述示踪物标记的CA215抗体中CA215抗体浓度为1～300ng/ml。本专利技术同时提供一种CA215检测试剂盒的制备方法，所述CA215检测试剂盒包括磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液、校准品以及洗涤液，其制备方法包括如下步骤：(1)制备磁分离试剂活化磁微粒：取羧基磁微粒于离心管中并充分混匀，将离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CA215检测试剂盒，其特征在于，其包括：磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液以及校准品；其中，所述磁分离剂为包被CA215抗体的磁微粒溶液；所述化学发光底物液为二乙醇胺缓冲液，所述二乙醇胺缓冲液包含3‑(2‑螺旋金刚烷)‑4‑甲氧基‑4‑(3‑磷氧酰)‑苯基‑1,2‑二氧环乙烷二钠盐；所述校准品采用CA215纯品配制，其标示浓度分别为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml、100AU/ml。

【技术特征摘要】
1.一种CA215检测试剂盒，其特征在于，其包括：磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液以及校准品；其中，所述磁分离剂为包被CA215抗体的磁微粒溶液；所述化学发光底物液为二乙醇胺缓冲液，所述二乙醇胺缓冲液包含3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐；所述校准品采用CA215纯品配制，其标示浓度分别为0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml、100AU/ml。2.根据权利要求1所述的CA215检测试剂盒，其特征在于，所述磁分离剂按照以下方法制备：(1)活化磁微粒：取充分混匀后的羧基磁微粒放于离心管中，将离心管放置于磁分离架上，待羧基磁微粒完全被吸附分离后，去除上清液，加入MES缓冲液洗涤羧基磁微粒至少一次；再加入EDC溶液和NHS溶液将羧基磁微粒活化；(2)包被磁微粒：用MES缓冲液洗涤活化后的羧基磁微粒至少一次，将离心管置于磁分离架上，分离去除上清液，加入2.5mg/ml的CA215抗体混匀，在室温下反应2～4小时，反应结束后，再将离心管置于磁分离架上，去除上清液，用乙醇胺溶液洗涤至少一次，然后再加入乙醇胺溶液于离心管中，室温反应2～4小时，反应结束后，去除上清液保存，其中，羧基磁微粒与CA215抗体的体积比为1：1；(3)采用磁珠悬浮液将步骤(2)制备的包被磁微粒稀释至0.1～1mg/ml。3.根据权利要求2所述的CA215检测试剂盒，其特征在于，所述羧基磁微粒为Fe3O4/Fe2O3磁性纳米粒子和有机高分子材料的聚合物，其平均粒径为0.5～5μm，优选1～3μm，且所述羧基磁微粒表面带有羧基、氨基和羟基中的一种或多种基团。4.根据权利要求2所述的CA215检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液按照以下方法配制：称取Tris-碱1.21g、氯化钠4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的纯化水，混匀后静置10min后用盐酸或氢氧化钠调节PH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明胶、1mol/L的氯化镁0.5ml、1mol/L的氯化锌0.05ml、1mol/L的氯化钙0.1ml和0.5mL的T-20，用纯化水定容到500mL，混匀过滤得到磁珠悬浮液。5.根据权利要求1所述的CA215检测试剂盒，其特征在于，所述示踪物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、金刚烷、鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯中的至少一种，优选碱性磷酸酶。6.根据权利要求1所述的CA215检测试剂盒，其特征在于，所述示踪物标记的CA215抗体中CA215抗体浓度为1～300ng/ml。7.一种CA215检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述CA215检测试剂盒包括磁分离剂、示踪物标记的CA215抗体、化学发光底物液、校准品以及洗涤液，其制备方法包括如下步骤：(1)制备磁分离剂活化磁微粒：取羧基磁微粒于离心管中并充分混匀，将离心管放置于磁分离架上，待羧基磁微粒完全被吸附分离后，去除上清液，加入MES缓冲液洗涤羧基磁微粒至少一次；再加入EDC溶液和NHS溶液将羧基磁微粒活化；包被磁微粒：用MES缓冲液洗涤活化后的羧基磁微粒至少一次，将离心管置于磁分离架上，分离去除上清液，加入2.5mg/ml的CA215抗体混匀，在室温下反应2～4小时，反应结束后，再将离心管置于磁分离架上，去除上清液，用乙醇胺溶液洗涤至少一次，然后再加入乙醇胺溶液于离心管中，室温反应2～4小时，反应结束后，去除上清液保存，其中羧基磁微粒与CA215抗体的体积比为1：1；采用磁珠悬浮液将制备的包被磁微粒稀释至0.1～1mg/ml得到磁分离剂的工作液；(2)制备示踪物标记的CA215抗体：活化碱性磷酸酶：取20mg/ml的碱性磷酸酶置于反应试管的底部，加入过量的40mmol/L的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，震荡混匀，室温条件下静置反应10～30min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液中和多余的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，反应10min后用Zeba脱盐柱纯化，得到活化的碱性磷酸酶；活化CA215抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琳，康丽波，李吉祐，魏照征，
申请(专利权)人：普菲特益斯生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11