免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物及其快速高产的制备方法技术

本发明专利技术涉及显示出显著高抗体效价的免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物。载体蛋白质获自革兰氏阳性菌的组，多糖片段获自革兰氏阴性菌的组，优选地获自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)血清型b(Hib)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组A和C(MenA和MenC)。本发明专利技术还涉及制备所述多糖-蛋白质缀合物的快速且高产的方法，其中采用还原胺化化学使衍生化的载体蛋白质与最佳长度的经切割和解聚的多糖片段反应以获得多糖-蛋白质缀合物。本发明专利技术还涉及使多糖片段化成用于缀合的最佳长度的化学方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物以及获得所述多糖-蛋白质缀合物的快速高产的缀合方法。更特别地，本专利技术提供了使用用于产生增强免疫原性的优化多糖链长度来开发的多糖蛋白质缀合物疫苗。本专利技术还涉及用于使多糖与载体蛋白质缀合的具有提高的产率和更高的免疫原性的还原胺化快速方法。
技术介绍
疫苗接种(免疫接种)是引发免疫应答的方式。疫苗接种的方法包括向活的实体施用疫苗，这继而激活人体的自然免疫系统。疫苗包含小剂量的抗原，其为减弱的病原体或死病原体(例如细菌或病毒或病原体结构的一部分)的制备物，其在施用后刺激抗体产生或针对病原体的细胞免疫。在免疫学上，可将抗原分类为T细胞依赖性(TD)抗原或T-细胞非依赖性(TI)抗原。蛋白质和肽通常是TD抗原并且需要来自辅助T淋巴细胞的刺激以便引发免疫应答，并且由于记忆B和T淋巴细胞的形成而诱导持久的免疫应答。与此相反，TI抗原刺激B细胞增殖和分化成分泌抗体的效应细胞，无需T细胞的帮助并且不形成记忆B和T淋巴细胞。大多数这些T细胞依赖性抗原是刺激产生低亲和力抗体的微生物多糖。在革兰氏阴性菌中，在细菌荚膜中存在的多糖是显示出差的免疫原性的重要毒力因子。缀合物疫苗是微生物多糖(polysaccharide，PS)抗原与载体蛋白质(carrierprotein，CP)偶联的产物，从而将T细胞非依赖性免疫应答转变成T细胞依赖性免疫应答。使用缀合物疫苗来免疫婴儿r>和儿童以抵抗包含荚膜多糖的细菌引起的侵入性疾病。抗原性荚膜多糖与载体蛋白质的偶联产生高度免疫原性的缀合物。碳水化合物-蛋白质缀合物在基础研究中被广泛使用并且作为多种细菌疫苗中的免疫原。已经付出了巨大的努力来开发用于构建这些缀合物的简单且可靠的方法。虽然通过还原胺化进行直接偶联是有有吸引力的方法，但其同样具有许多缺点。通过还原胺化的现有缀合方法是耗时且低产率的方法，同时如此得到的缀合物显示出较低的免疫原性。多糖-蛋白质缀合物的免疫学性能是长度依赖的，可能需要优化多个表位也是一个公认的事实(Costantino等，1999)。还已知较小多糖片段的选择性末端基团活化方法以一致的再现性产生了很好地限定了缀合物疫苗。较大尺寸的多糖分子可具有空间上隐藏的表位，然而较小的片段在缀合后将具有暴露于免疫系统的最大表位。已经开发了用于制备较小的多糖片段的数种方法，包括多糖的解聚。在现有技术中已充分地描述了多糖的解聚。例如，Laferriere等，2011年的文章“ExperimentaldesigntooptimizeanHaemophilusinfluenzaetypebconjugatevaccinemadewithhydrazide-derivatizedtetanustoxoid”对其进行了详细的描述。一个主要的缺点是该方法花费很长的时间(32小时以上)，并具有约15％的缀合物产率。Anderson等，1986年也描述了使用较小尺寸的多糖用于与白喉类毒素缀合，并发现由20个重复单元的Hib-PRP制成的缀合物比由8个重复单元制成的那些具有更强的免疫原性。他们的方法也花费很长的时间，即超过5天。本专利技术通过提供用于使多糖与载体蛋白质缀合的具有提高的产率和更高的免疫原性的还原胺化的快速方法克服了现有技术的缺点。本专利技术的方法需要较短的缀合时间。本专利技术还提供了通过向免疫系统更好地暴露抗原表位的免疫原性增强的小尺寸多糖。专利技术目的因此，本专利技术的主要目的是提供免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物。本专利技术的另一个目的是提供用于多糖片段化的化学方法。本专利技术的另一个目的是提供用于流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)b型(Hib)的免疫原性增强的较低分子量(LowerMolecularWeight，LMW)多糖蛋白质缀合物疫苗。本专利技术的另一个目的是提供用于脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)血清组A和C(MenA和MenC)的免疫原性增强的较高分子量(HigherMolecularWeight，HMW)多糖蛋白质缀合物疫苗。本专利技术的另一个目的是提供获得具有较短缀合时间和更高缀合物产率的多糖-蛋白质缀合物的快速方法。
技术实现思路
因此，本专利技术提供了免疫原性增强的多糖-蛋白缀合物和获得所述多糖-蛋白质缀合物及其疫苗的快速高产率缀合方法。本专利技术提供了优化分子量的多糖-蛋白质缀合物，其中多糖被片段化成分子量在100±40kD的范围内，更优选地具有约100kD的平均分子量。本专利技术还提供了制备Hib多糖-蛋白质缀合物的优化的低分子量多糖，其中多糖片段被片段化为分子量在12±6kD的范围内，更优选地具有约10kd的平均分子量。本专利技术还公开了用于将Hib荚膜多糖(即PRP(聚核糖基-核糖醇-磷酸))化学分解为12±6kD的尺寸的具有较低多分散性且具有可再现性结果的方法。本专利技术还公开了用于将天然荚膜多糖(例如但不限于MenA和MenC)化学分解为100±40kD的尺寸的方法，其示出了可再现结果的低多分散性。在一个优选的实施方案中，本专利技术提供了多糖的化学降解，其中将所述多糖样品与偏高碘酸钠(sodium-metaperiodate)放在一起保持预定的时间并在凝胶过滤柱上直接脱盐。纯化所述的多糖样品并对纯化的多糖进行分析测定用以评估物理化学性质，包括PS含量、唾液酸含量、磷含量、蛋白质杂质、核酸杂质、内毒素、同一性以及水分含量。分析纯化的多糖的总含量并通过产生醛基进行衍生化。本专利技术还提供了多糖-蛋白质缀合物，其中可在较小的多糖片段上进行选择性的末端基团活化。对于Hib多糖和脑膜炎球菌血清组，典型的多糖被氧化剂(例如偏高碘酸盐/酯(metaperiodate))分别片段化为约10kD和100kD的较小质量，并使用还原胺化化学将其与衍生化的载体蛋白质缀合。载体蛋白质是破伤风类毒素、CRM197或其他合适的载体蛋白质，其被激活并分析蛋白质含量和活化度(degreeofactivation)。在催化试剂的存在下，使用一水合肼作为接头将肼基团与载体蛋白质连接。所述催化试剂的非限制性实例是EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)。缀合步骤包括衍生化的多糖与衍生化的载体蛋白质(例如破伤风类毒素)的缀合。进一步纯化多糖-蛋白质缀合物并分析蛋白质含量与多糖含量之比、游离多糖、尺寸分布和效力。本专利技术还进行了本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫原性增强的多糖‑蛋白质缀合物，其包含载体蛋白质、多糖片段，其中‑所述载体蛋白质获自革兰氏阳性菌，优选但不限于破伤风类毒素(TT)和CRM197，‑所述多糖片段获自革兰氏阴性菌的组，所述革兰氏阴性菌包括但不限于：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)血清型b(Hib)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组A和C(MenA和MenC)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.11 IN 3047/DEL/2013;2014.08.20 IN 2363/DEL1.免疫原性增强的多糖-蛋白质缀合物，其包含载体蛋白质、多糖片
段，其中
-所述载体蛋白质获自革兰氏阳性菌，优选但不限于破伤风类毒素
(TT)和CRM197，
-所述多糖片段获自革兰氏阴性菌的组，所述革兰氏阴性菌包括但不
限于：流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)血清型b(Hib)、
脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)血清组A和C(MenA和
MenC)。
2.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖是Hib、
MenA或MenC荚膜多糖。
3.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中游离多糖的百分比
低于10％，并且活化多糖与活化TT之比为：
-对于HibPRP-TT缀合物，在0.2至0.5(wt/wt)的范围内，更优
选0.25至0.35(wt/wt)，
-对于MenA-TT缀合物和MenC-TT缀合物，在0.2至0.8(wt/wt)
的范围内，更优选0.3至0.7(wt/wt)。
4.如权利要求1所述的多糖-蛋白质缀合物，其中所述多糖-蛋白质缀
合物在0.5μg至1μg的剂量下显示出显著高的抗体效价。
5.制备如权利要求1所述多糖-蛋白质缀合物的方法，所述方法包括
以下步骤：
(a)在交联剂的存在下，通过使至少一种载体蛋白质与至少一种亲
核试剂反应来使所述载体蛋白质衍生化，其中所述载体蛋白质
获自革兰氏阳性菌，优选地选自破伤风类毒素和CRM197；
(b)通过使至少一种高分子量多糖与至少一种氧化剂反应来切割所
述多糖并使其解聚以产生经切割且活化的较小尺寸的多糖片
段，其中所述高分子量多糖获自革兰氏阴性菌的组，所述革兰
氏阴性菌包括但不限于流感嗜血杆菌b型(HibPRP)、脑膜炎
奈瑟菌血清组A(MenA)和脑膜炎奈瑟菌血清组C(MenC)；
(c)采用还原胺化化学使步骤(a)的所述衍生化的载体蛋白质与步

\t骤(b)的所述活化的多糖片段进行缀合反应以得到多糖-蛋白
质缀合物；
其中，
-所述缀合反应从多糖的活化阶段直到所述缀合物的最终纯
化花费14至22小时的短缀合时间，
-所述方法产生更高产率的多糖-蛋白质缀合物，
-所述多糖-蛋白质缀合物显示出显著高的抗体效价，所述抗
体包括功能性抗体。
6.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述交
联剂是促进羧基与胺交联的化学交联试剂，在EDC存在下，所述交联剂
优选为一水合肼。
7.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述亲
核试剂选自还原剂的组，优选为肼。
8.如权利要求5所述的制备多糖-蛋白质缀合物的方法，其中所述衍
生化的破伤风类毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：达温德·吉尔，马诺伊·库马尔·奇卡拉，拉凯什·拉纳，琼德·达拉尔，迪普蒂·辛格，维布胡·干乍，
申请(专利权)人：默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN