一个水稻未知膜蛋白基因OsMP1及其在抗病基因工程中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，涉及一个水稻未知膜蛋白基因OsMP1及其在抗病基因工程中的应用。水稻基因OsMP1，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的水稻膜蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术公开了水稻膜蛋白基因OsMP1及其所编码的蛋白质。水稻膜蛋白基因OsMP1为水稻中首次报道，是根据分析黑壳子粳接种稻瘟病菌前后基因芯片和iTRAQ蛋白组学结果，筛选到的一个明显受稻瘟病接种诱导表达的未知膜蛋白基因。mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，并且转基因水稻植株的苗瘟抗性获得增强。因此有望可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及一种水稻未知膜蛋白基因OsMP1及其在抗病基因工程中的应用。
技术介绍
植物质膜蛋白位于细胞和外界的交界处，能够介导细胞和外界的信号传导，执行细胞基本重要的生物学功能。质膜蛋白在植物抵御病原物侵染防卫反应信号传导途径中起到了非常重要的作用。本专利技术克隆的OsMP1为水稻未知质膜蛋白，其表达明显受稻瘟病菌接种诱导，其转基因植株的抗瘟性明显增强。研究OsMP1的功能并将其在抗病基因工程中加以应用，对提高水稻抗稻瘟病抗性有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开水稻未知膜蛋白基因OsMP1。本专利技术的另一目的是提供基因OsMP1的抗病性基因工程应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：水稻基因OsMP1，该基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述的水稻基因OsMP1编码的水稻膜蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。含有所述的水稻基因OsMP1的表达载体。所述的表达载体优选将所述的水稻基因OsMP1插入表达载体Ubi-pBA002的SpeⅠ酶切位点所得。本专利技术所述的水稻基因OsMP1的基因工程应用。本专利技术所述的水稻膜蛋白基因OsMP1在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应用。利用所述的水稻膜蛋白基因OsMP1在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种，通常先利用本专利技术OsMP1基因作为目的基因构建植物表达载体，再将含该基因的重组表达载体转化目标植物。利用本专利技术OsMP1基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括具有抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β‐葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。水稻膜蛋白基因OsMP1的基因工程应用，优选包括如下步骤：1)提取水稻抗稻瘟病菌品种“黑壳子粳”总RNA2)水稻基因OsMP1的克隆将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板，P1:SEQIDNO.3和P2:SEQIDNO.4为引物，用高保真酶进行PCR扩增后连接至pEASY-T1Blunt载体，测序获得水稻基因OsMP1的cDNA序列SEQIDNO.1；3)植物表达载体的构建根据水稻OsMP1基因的cDNA序列SEQIDNO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别同一引入限制性内切酶位点SpeⅠ，P3和P4引物序列分别为：SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsMP1的cDNA利用引入的限制性内切酶位点SpeⅠ，通过重组法将OsMP1克隆到表达载体Ubi-pBA002，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体Ubi-pBA002-OsMP1转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行realtimePCR验证后进行水稻的抗病性评价，得到抗稻瘟病品种。有益效果1、本专利技术公开了水稻膜蛋白基因OsMP1及其所编码的蛋白质。水稻膜蛋白基因OsMP1为水稻中首次报道，黑壳子粳接种稻瘟病菌前后基因芯片分析、iTRAQ蛋白组学结果和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种明显诱导。因此有望可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。2、本专利技术的OsMP1基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。3、构建表达载体获得转基因植株，获得过量表达的转基因植株抗性明显增强，而点突变敲除表达的转基因植株的抗性明显减弱，说明该基因与水稻稻瘟病抗性有关，具有基因工程应用价值。4、利用DUALmembrane系统，在黑壳子粳cDNA文库中筛选到了一个OsMP1的互作蛋白MP-P1具有SNARE_assoc结构域，属于SNARE相关的高尔基蛋白家族，含有SNARE结构域的蛋白能够在植物防御反应中发挥重要的作用。附图说明图1、OsMP1蛋白的亚细胞定位结果表明，其主要定位于水稻质膜。图2、OsMP1蛋白的酵母双杂交结果。具体实施方式实施例11)总RNA的提取选用水稻品种“黑壳子粳”(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)，待水稻幼苗长至3‐4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，分别取处理后0h,4h,8h,12h,24h,48h的叶片，立即用液氮冷冻，保存于‐80℃冰箱。分别取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管(TRIzolReagents,购自Invitrogen,USA)，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。2)水稻膜蛋白基因OsMP1的克隆分析黑壳子粳接种稻瘟病前后的蛋白质组学结果发现该膜蛋白受到稻瘟病菌接种的明显诱导。以日本晴基因OsMP1序列为探针序列，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到1408bp水稻膜蛋白基因OsMP1的全长序列，并设计两端引物P1和P2：P1:5‐CACGCCTTGCTATTCCTGTA‐3(SEQIDNO.3)，P2:5‐GATTACTCTAACCCGCCCATA‐3(SEQIDNO.4)，以步骤1)获得的总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，以P1和P2为引物，用高保真酶(购自Roche)进行PCR扩增，PCR程序如下：95℃预变性5min，95℃变性40sec，56℃复性40sec，72℃延伸90sec，30个循环后，72℃延伸5min，最后72℃延伸10min后连接至pEASY-T1Blunt载体，委托南京思普金公司测序获得膜蛋白基因OsMP1的cDNA序列SEQIDNO.1。分析上述获得的水稻膜蛋白基因OsMP1的cDNA序列SEQIDNO.1及其编码蛋白SEQIDNO.2。实施例2用实施例1中设计的引物P1、P2进行实时定量RT‐PCR分析接种处理后水稻3‐4叶期地上部幼苗的表达，结果表明，接种稻瘟病菌孢子4小时后OsMP1本文档来自技高网...

【技术保护点】
水稻基因OsMP1，其特征在于该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.水稻基因OsMP1，其特征在于该基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1所述的水稻基因OsMP1编码的水稻膜蛋白，其特征在于其氨基酸序列如
SEQIDNO.2所示。
3.含有权利要求1所述的水稻基因OsMP1的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将所述的水稻基因
OsMP1插入表达载体Ubi-pBA002的SpeⅠ酶切位点所得。
5.权利要求1所述的水稻基因OsMP1的基因工程应用。
6.权利要求1所述的水稻基因OsMP1在通过基因工程手段培育稻瘟病抗性品种中的应
用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
1)提取水稻抗稻瘟病菌品种“黑壳子粳”总RNA
2)水稻基因OsMP1的克隆
将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板，P1:SEQIDNO.3和P2:SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍永美，张红生，张莹，黄骥，王建飞，王州飞，程金平，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32