一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法，所述方法通过诱变处理筛选出淀粉利用能力强的刺糖多孢菌多杀菌素高产突变株，其中，所述诱变处理包括紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变中的至少2种诱变方式；优选的，包括至少4种诱变方式；更为优选的，所述诱变方式的实施顺序为依次进行紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变。采用本发明专利技术所提供的方法获得的突变菌株经发酵培养后发酵液中多杀菌素的效价显著高于诱变筛选的出发菌株，说明利用本发明专利技术所提供的方法能够提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物发酵领域，具体的，涉及一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法。
技术介绍
多杀菌素，是刺糖多孢菌有氧发酵产生的次级代谢产物，属于大环内酯类化合物，其商业化产品中有效的活性组分为多杀菌素A(85％-90％)和多杀菌素D(10％-15％)。多杀菌素没有抑菌活性，却有很好的杀虫活性，对鳞翅目和缨翅目害虫有较广的杀虫谱，对双翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类有很好的防治作用，在防治鳞翅目害虫上，多杀菌素是现有杀虫剂中选择性最高的化合物之一，其活性与氯氰菊酯相当。多杀菌素具有高杀虫活性的同时，对非靶标生物则表现出低毒，它对哺乳动物、鸟类和有益昆虫毒性较低，对水生动物只有轻微的毒性，而且对哺乳动物无致癌、致畸、致突变或神经毒性的作用。与一般杀虫剂相比，多杀菌素具有见效快、无副作用、选择性高、对天敌安全、半衰期短、易降解、不易产生药物抗性等优点，是理想的高效低毒绿色农药，是治理抗性害虫的首选替代农药新品种。在实际生产中需要利用刺糖多孢菌通过发酵过程生产多杀菌素。在利用刺糖多孢菌对多杀菌素进行发酵生产的过程中，淀粉因具有价格低，来源广，可解除葡萄糖效应等优点，常作为迟效碳源添加到培养基中，在生产实践中，现有的用于生产多杀菌素的刺糖多孢菌普遍存在对发酵培养基中的淀粉利用率低下的缺陷，发酵液中经常残留未被有效利用的多糖物质，导致最终获得的发酵液非常粘稠，加大了后r>期多杀菌素提取的难度，增加了资源的浪费。重要的是，淀粉利用率低下的菌株也伴随着多杀菌素发酵产量低的缺陷。因此有必要提供一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法。为了达到这一目的，本专利技术提供了一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法，所述方法通过诱变处理筛选出淀粉利用能力强的刺糖多孢菌多杀菌素高产突变株，其中，所述诱变处理包括紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变中的至少2种诱变方式；优选的，包括至少4种诱变方式；更为优选的，所述诱变方式的实施顺序为依次进行紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变。优选的，所述方法还包括在实施每一种诱变方式后利用淀粉水解培养基对诱变处理后的菌株进行培养，再利用碘液筛选淀粉利用能力强的刺糖多孢菌突变菌株。优选的，所述紫外线复合链霉素诱变的步骤包括，利用20-40W的紫外照射仪在20-40cm处对刺糖多孢菌的孢子悬液照射30s-60s后获得紫外诱变菌悬液，再将所述紫外诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。优选的，所述5-氟尿嘧啶诱变的步骤包括，将菌株在无有机氮源的饥饿培养基中培养8-12h后接种于5-氟尿嘧啶浓度为50-80μg/mL的培养基中培养8-12天。优选的，所述微波复合链霉素诱变的步骤包括，以脉冲频率为2400-2500MHz、功率为500-900W的微波对菌悬液进行60-120s辐照处理后获得微波诱变菌悬液，再将微波诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。优选的，所述亚硝基胍复合链霉素诱变的步骤包括，用含有浓度为2-8mg/mL的亚硝基胍的磷酸盐缓冲液制备刺糖多孢菌孢子悬液，将所述孢子悬液在25-30℃下震荡处理20-40min后进行洗涤和稀释获得亚硝基胍诱变菌悬液，再将亚硝基胍诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。优选的，所述含有链霉素的培养基中链霉素的浓度为0.1-0.2μg/mL。优选的，所述淀粉水解培养基的pH值为7.0-7.4，淀粉水解培养基中各组分的含量为：可溶性淀粉10-20g/L、磷酸氢二钾0.3-0.5g/L、碳酸镁0.5-1g/L、氯化钠0.3-0.6g/L、硝酸钾0.5-1g/L和琼脂15-20g/L。优选的，所述方法按照以下步骤进行：步骤一：对刺糖多孢菌出发菌株进行紫外线复合链霉素诱变后进行第一次淀粉利用能力筛选，获得第一突变菌株；步骤二：对第一突变菌株进行5-氟尿嘧啶诱变后进行第二次淀粉利用能力筛选，获得第二突变菌株；步骤三：对第二突变菌株进行微波复合链霉素诱变后进行第三次淀粉利用能力筛选，获得第三突变菌株；步骤四：对第三突变菌株进行亚硝基胍复合链霉素诱变后进行第四次淀粉利用能力筛选，获得多杀菌素高产突变株。优选的，发酵过程包括将所述多杀菌素高产突变株接种在斜面培养基中培养后转接到种子培养基中培养获得种子培养液，再将种子培养液接种到发酵培养基中进行发酵培养得到发酵液。根据本专利技术所提供的方法获得的刺糖多孢菌高产突变株能够对发酵培养基中的淀粉原料进行充分的利用，显著降低发酵培养基中的总糖和非还原糖含量，避免了发酵液中大量未被有效利用的多糖物质残留所导致的发酵液非常粘稠的缺陷，降低了后期多杀菌素提取的难度的同时也节省了资源，最主要的是，按照本专利技术所提供的方法筛选出的突变株具有优异的多杀菌素高产性能，发酵获得的清液中多杀菌素效价更高。具体实施方式下面将通过具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术提供了一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法，所述方法通过诱变处理筛选出淀粉利用能力强的刺糖多孢菌多杀菌素高产突变株，其中，所述诱变处理包括紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变中的至少2种诱变方式；优选的情况下，所述诱变处理由紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变组成。在本专利技术中，对于各种诱变方法在实施时的先后顺序没有特别的限制，只要能够保证完成各个诱变过程即可。更为优选的情况下，所述诱变方式的实施顺序为依次进行紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变。在本专利技术中，所述刺糖多孢菌的拉丁学名为Saccharopolysporaspinosa，属糖多孢菌属，是一种好氧性革兰氏阳性的非抗酸性放线菌，具有多杀菌素生产功能。根据本专利技术，所述紫外线复合链霉素诱变的步骤包括，利用20-40W的紫外照射仪在20-40cm处对刺糖多孢菌的孢子悬液进行照射后获得紫外诱变菌悬液，再将所述紫外诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法，其特征在于，所述方法通过诱变处理筛选出淀粉利用能力强的刺糖多孢菌多杀菌素高产突变株，其中，所述诱变处理包括紫外线复合链霉素诱变、5‑氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变中的至少2种诱变方式；优选的，包括至少4种诱变方式；更为优选的，所述诱变方式的实施顺序为依次进行紫外线复合链霉素诱变、5‑氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变。

【技术特征摘要】
1.一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法，其特征在
于，所述方法通过诱变处理筛选出淀粉利用能力强的刺糖多孢菌多杀
菌素高产突变株，其中，所述诱变处理包括紫外线复合链霉素诱变、
5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变中
的至少2种诱变方式；
优选的，包括至少4种诱变方式；
更为优选的，所述诱变方式的实施顺序为依次进行紫外线复合链
霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链
霉素诱变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括
在实施每一种诱变方式后利用淀粉水解培养基对诱变处理后的菌株
进行培养，再利用碘液筛选淀粉利用能力强的刺糖多孢菌突变菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述紫外线复合
链霉素诱变的步骤包括，利用20-40W的紫外照射仪在20-40cm处对
刺糖多孢菌的孢子悬液照射30s-60s后获得紫外诱变菌悬液，再将所
述紫外诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述5-氟尿
嘧啶诱变的步骤包括，将菌株在无有机氮源的饥饿培养基中培养
8-12h后接种于5-氟尿嘧啶浓度为50-80μg/mL的培养基中培养8-12
天。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所
述微波复合链霉素诱变的步骤包括，以脉冲频率为2400-2500MHz、
功率为500-900W的微波对菌悬液进行60-120s辐照处理后获得微波
诱变菌悬液，再将微波诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培
养。
6.根据权利要求2-5中任意一项所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王书睿，周贤龙，刘静，
申请(专利权)人：牡丹江佰佳信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23