本发明专利技术公开了一种海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法和鉴定引物。本发明专利技术方法是基于海南黄花梨和越南黄花梨之间质体基因rpoC2和petD序列差异提供的分子鉴定方法，包括待鉴定样品进行总DNA提取、PCR扩增rpoC2和petD序列以及将其测序后与海南黄花梨和越南黄花梨标准样品rpoC2和petD序列比对的步骤。该方法能准确快速的鉴定区分海南黄花梨和越南黄花梨，解决了依靠传统木材解剖手段无法鉴别二者的难题，为木材市场、商家、消费者、公安机关、海关和科研机构提供一种高效可靠的海南黄花梨和越南黄花梨鉴别方法，具有很强的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子标记
，具体涉及一种海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法和鉴定引物。
技术介绍
海南黄花梨，又名降香黄檀(DalbergiaordoriferaT.Chen)是豆科黄檀属(DalbergiaL.)植物，为高大乔木，特产我国海南，是众所周知的最为名贵的红木种类，目前市场上每公斤海南黄花梨木材的销售价格已经超过1万元人民币。海南黄花梨高昂的市场价格所造成的巨大利益驱动，导致市场上大量出现走私售假的不法行为。我们通过走访红木市场和商家企业发现，目前市场上超过90％的海南黄花梨均产于越南、价格不到海南黄花梨一半的越南黄花梨(又名越南黄檀DalbergiatonkinensisPrain)走私到我国并冒充海南黄花梨。假冒现象如此普遍的原因则在于，传统的木材解剖等鉴定手段原则上只能鉴定到大类，不可能鉴定到具体的物种。例如，对于一个样品，利用传统的木材鉴定方法，可将其鉴定为黄檀类或香枝木类木材，而不可能准确鉴定为海南黄花梨或越南黄花梨。生物的DNA含有大量的遗传密码信息，这些遗传密码信息可以用于物种之间甚至同一个物种不同个体之间的鉴定，广为人知的人类亲子鉴定便是其中一例。对于木材的鉴定，传统的木材鉴定方法，包括木材解剖、物理和化学指标检测，都只能鉴定到大类，即属于某一类型的木材，而不可能准确鉴定到具体的原生树种。相比而言，针对性地开发特殊的植物质体DNA测序引物，测得目标物种特异的DNA序列，通过和标准样品进行DNA比对，能够更准确地进行木材样品的原生树种鉴定。这是因为(1)质体DNA为植物所特有，在进行DNA序列测序和比对分析的时候方便排除木材中附带的木材内生真菌DNA的影响；(2)质体DNA在植物中的含量远远高于核DNA，对一些保存状况不甚理想的木材样品，也方便获得足够的DNA进行样品分析；(3)植物质体DNA为环状结构，其中的每个基因仅有一个拷贝，避免了核基因多个拷贝的存在而产生的假阳性现象。因此，如能开发一种利用海南黄花梨与越南黄花梨质体DNA序列的差异而对二者进行准确鉴定方法将能弥补传统鉴定方法的不足，提供一种有效的鉴定手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对传统木材鉴定方法不能准确鉴定区分海南黄花梨和越南黄花梨的不足，提供一种基于质体基因rpoC2和petD序列差异的海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法和鉴定引物。本专利技术的海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法，包括以下步骤：a、对待鉴定样品进行总DNA提取；b、PCR扩增：以步骤a提取的总DNA为模板，分别用rpoC2序列的正/反向引物和petD序列的正/反向引物进行PCR扩增，分别得到扩增产物；所述的rpoC2序列的正向引物的碱基序列如SEQIDNO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的碱基序列如SEQIDNO.6所示，所述的petD序列的正向引物的碱基序列如SEQIDNO.7所示，所述的petD序列的反向引物的碱基序列如SEQIDNO.8所示；c、序列比对：将扩增产物测序，然后将测序的rpoC2序列与SEQIDNO.1和SEQIDNO.3进行比对，将测序的petD序列与SEQIDNO.2和SEQIDNO.4进行比对；如果rpoC2序列与SEQIDNO.1一致、petD序列与SEQIDNO.2一致，则该待鉴定样品为海南黄花梨；如果rpoC2序列与SEQIDNO.3一致、petD序列与SEQIDNO.4一致，则该待鉴定样品为越南黄花梨。优选，所述的步骤a的对待鉴定样品进行总DNA提取后，还用PEG试剂对总DNA进行纯化并使DNA终浓度为50-200ng/μl。优选，所述的步骤b的PCR扩增的反应体系为：含有Buffer(Mg2+plus)5μl、dNTPMixture(2.5mM)2μl、正向引物(10μM)0.5μl、反向引物(10μM)0.5μl、总DNA模板1μl和HSDNAPolymerase(2.5U/μl)0.25μl，其余由灭菌蒸馏水补足至25μl；反应条件为：95℃3min；94℃30s，50-52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。本专利技术还提供了海南黄花梨和越南黄花梨的鉴定引物，所述的鉴定引物包括rpoC2序列的正/反向引物和petD序列的正/反向引物，所述的rpoC2序列的正向引物的碱基序列如SEQIDNO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的碱基序列如SEQIDNO.6所示，所述的petD序列的正向引物的碱基序列如SEQIDNO.7所示，所述的petD序列的反向引物的碱基序列如SEQIDNO.8所示。本专利技术首次对海南黄花梨和越南黄花梨的两个质体基因rpoC2和petD进行了测序分析，发现质体基因rpoC2和petD均在海南黄花梨和越南黄花梨之间存在显著差异。利用这种特性，用rpoC2的正/反向引物和petD的正/反向引物分别对未知黄檀类或香枝木类木材样品的总DNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行测序，将扩增到的未知样品的rpoC2序列与海南黄花梨和越南黄花梨标准样品的rpoC2序列比对，扩增到的未知样品的petD序列与海南黄花梨和越南黄花梨标准样品的petD序列比对，根据比对的序列一致性结果即可判断该未知样品是海南黄花梨还是越南黄花梨。对于DNA未降解的木材样品，本专利技术的方法可在10个工作日内获得其质体基因rpoC2和petD序列，通过与标准样品进行比较，可有效鉴别待鉴定样品与海南黄花梨和越南黄花梨标准样品的DNA相似性的支持率达到99％以上。首次解决了依靠传统木材解剖手段无法鉴别海南黄花梨和越南黄花梨的难题，为木材市场、商家、消费者、公安机关、海关和科研机构提供一种高效可靠的海南黄花梨和越南黄花梨鉴别方法，具有很强的应用价值。本专利技术的方法还可在建立标准样品DNA信息库的基础上，用于鉴定豆科其他重要近缘经济植物原生种类，例如观赏植物羊蹄甲属、粮油植物大豆属等。附图说明图1是海南黄花梨和越南黄花梨的rpoC2序列比对结果，Do-rpoC2表示海南黄花梨(DalbergiaordoriferaT.Chen)的rpoC2序列，Dt-rpoC2表示越南黄花梨(DalbergiatonkinensisPrain)的rpoC2序列。图2是海南黄花梨和越南黄花梨的petD序列比对结果，Do-petD表示海南黄花梨(DalbergiaordoriferaT.Chen)的petD序列，Dt-petD表示越南黄花梨(DalbergiatonkinensisPrain)的petD序列。具体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：a、对待鉴定样品进行总DNA提取；b、PCR扩增：以步骤a提取的总DNA为模板，分别用rpoC2序列的正/反向引物和petD序列的正/反向引物进行PCR扩增，分别得到扩增产物；所述的rpoC2序列的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的碱基序列如SEQ ID NO.6所示，所述的petD序列的正向引物的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，所述的petD序列的反向引物的碱基序列如SEQ ID NO.8所示；c、序列比对：将扩增产物测序，然后将测序的rpoC2序列与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3进行比对，将测序的petD序列与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4进行比对；如果rpoC2序列与SEQ ID NO.1一致、petD序列与SEQ ID NO.2一致，则该待鉴定样品为海南黄花梨；如果rpoC2序列与SEQ ID NO.3一致、petD序列与SEQ ID NO.4一致，则该待鉴定样品为越南黄花梨。
【技术特征摘要】
1.一种海南黄花梨和越南黄花梨的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、对待鉴定样品进行总DNA提取；
b、PCR扩增：以步骤a提取的总DNA为模板，分别用rpoC2序列的正/反向引物和petD
序列的正/反向引物进行PCR扩增，分别得到扩增产物；所述的rpoC2序列的正向引
物的碱基序列如SEQIDNO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的碱基序列如SEQ
IDNO.6所示，所述的petD序列的正向引物的碱基序列如SEQIDNO.7所示，所述
的petD序列的反向引物的碱基序列如SEQIDNO.8所示；
c、序列比对：将扩增产物测序，然后将测序的rpoC2序列与SEQIDNO.1和SEQIDNO.3
进行比对，将测序的petD序列与SEQIDNO.2和SEQIDNO.4进行比对；如果rpoC2
序列与SEQIDNO.1一致、petD序列与SEQIDNO.2一致，则该待鉴定样品为海南
黄花梨；如果rpoC2序列与SEQIDNO.3一致、petD序列与SEQIDNO.4一致，则
该待鉴定样品为越南黄花梨。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：涂铁要，李世晋，李永泉，朱成杰，李显强，刘俊芳，张奠湘，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，广东省林业科技推广总站，
类型：发明
国别省市：广东;44
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