用于对NRAS和BRAF核酸进行多重分析的组合物及方法技术

本文描述了涉及对NRAS和/或BRAF的改变(例如拷贝数和表达水平的变异和/或突变(包括点突变)的存在)进行检测的方法和测定法。现有方法由于例如有限的灵敏度、实验室间不一致或不能提供必要的多重性能，在临床适用性方面受到限制。本文提供的方法和测定法允许对患者实施更快更经济的测试和筛查的多模态、多重测定法，使得健康护理得到改进。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年8月14日提交的美国临时申请号61/865,754的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。序列表本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并在此以引用的方式将其整体并入。所述ASCII副本创建于2014年7月29日，命名为046264-078891-PCT_SL.txt，大小为28,830字节。
本文所述的技术涉及使得能够对突变(包括点突变)的存在和/或不存在进行检测的测定法和方法。
技术介绍
个性化医疗的发展使得鉴别了当被突变和改变时可引起疾病的基因。例如，在与野生型或健康受试者相比时，在患有给定疾病或具有发展为给定疾病风险的受试者中，编码基因的序列可能突变。例如，NRAS和BRAF与癌症相关，任何给定的癌细胞均可展示出NRAS和BRAF二者或之一的突变。这些突变与例如疾病的严重程度和/或对特定治疗选项的应答相关。用于检测此类突变的传统方法提供的多重性(multiplex)能力低于综合临床诊断所需的水平。多重测定法的开发可允许更快更经济地对患者进行测试和筛查，使得健康护理得到改进。
技术实现思路
本文所述的技术涉及用于对NRAS和/或BRAF的突变(例如序列的改变)进行检测的方法和测定法。专利技术人开发了测定法并发现了方法，以在单个多重测定法中对NRAS和/或BRAF的突变的存在或不存在进行可靠测定。一方面，本文描述了用于对NRAS和/或BRAF的突变进行检测的测定法，所述测定法包括：将核酸样本的部分与引物组相接触，其中，所述引物组包含引物对亚组，其中，各引物对扩增包含序列变异的NRAS或BRAF序列；对包含所述样本的所述部分和一个或多个所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案(regimen)，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子存在或不存在，其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异，以及其中，所述引物中的一个或多个选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：39所组成的组。在一些实施方式中，所述引物对选自于由如下引物对所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQIDNO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQIDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。在一些实施方式中，一个或多个序列变异为点突变。在一些实施方式中，NRAS点突变选自于由如下点突变所组成的组：G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2。在一些实施方式中，BRAF点突变选自于由如下点突变所组成的组：V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA。在一些实施方式中，对存在或不存在G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2进行检测。在一些实施方式中，对存在或不存在V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA进行检测。在一些实施方式中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。在一些实施方式中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。在一些实施方式中，一种或多种引物为双结构域引物。在一些实施方式中，来自引物组的两种以上引物对的扩增产物为可区分的。在一些实施方式中，借助有区别的大小(distinctsizes)，将来自引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，通过用不同的可检测标记物进行标记，将来自引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。在一些实施方式中，所述引物以约为实施例1的浓度存在于反应混合物中。一方面，本文描述了包含一个或多个引物对的组合物，所述引物对选自于由具有如下序列的分子所组成的组：SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQIDNO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQIDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于对NRAS和/或BRAF的突变进行检测的测定法，所述测定法包括：将核酸样本的部分与引物组相接触，其中，所述引物组包含引物对亚组，其中，各引物对扩增包含序列变异的NRAS或BRAF序列；对包含所述样本的所述部分和一个或多个所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；检测各引物对的扩增子存在或不存在；其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异；以及其中，所述引物中的一个或多个选自于由SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：39所组成的组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.14 US 61/865,7541.一种用于对NRAS和/或BRAF的突变进行检测的测定法，所述测定法包括：
将核酸样本的部分与引物组相接触，
其中，所述引物组包含引物对亚组，其中，各引物对扩增包含序列变异的NRAS或BRAF序
列；
对包含所述样本的所述部分和一个或多个所述引物组的反应混合物实施PCR扩增方
案，所述扩增方案包括链分离、引物退火和引物延伸的循环；
检测各引物对的扩增子存在或不存在；
其中，扩增子的存在表明存在该引物对对其具有特异性的序列变异；以及
其中，所述引物中的一个或多个选自于由SEQIDNO：1-SEQIDNO：39所组成的组。
2.如权利要求1所述的测定法，其中，所述引物对选自于由如下引物对所组成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：
8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；
SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：
14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQID
NO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQ
IDNO：18；SEQIDNO：19和SEQIDNO：33；SEQIDNO：20和SEQIDNO：33；SEQIDNO：21和
SEQIDNO：33；SEQIDNO：22和SEQIDNO：33；SEQIDNO：23和SEQIDNO：33；SEQIDNO：
24和SEQIDNO：33；SEQIDNO：25和SEQIDNO：33；SEQIDNO：26和SEQIDNO：32；SEQID
NO：27和SEQIDNO：32；SEQIDNO：28和SEQIDNO：32；SEQIDNO：29和SEQIDNO：32；SEQ
IDNO：30和SEQIDNO：32；SEQIDNO：31和SEQIDNO：32；SEQIDNO：34和SEQIDNO：37；
SEQIDNO：35和SEQIDNO：38；以及SEQIDNO：36和SEQIDNO：39。
3.如权利要求1或2所述的测定法，其中，一个或多个所述序列变异为点突变。
4.如权利要求1-3中任一项所述的测定法，其中，NRAS点突变选自于由如下点突变所组
成的组：
G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2。
5.如权利要求1-4中任一项所述的测定法，其中，BRAF点突变选自于由如下点突变所组
成的组：
V600DTG/AT、V600ET/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA。
6.如权利要求1-5中任一项所述的测定法，其中，对存在或不存在G12D、G12S、G13A、
G13C、G13D、G12R、G13V、Q61H1、Q61K、Q61L、Q61R1以及Q61R2进行检测。
7.如权利要求1-6中任一项所述的测定法，其中，对存在或不存在V600DTG/AT、V600E
T/A、V600ETG/AA以及V600KGT/AA进行检测。
8.如权利要求1-7中任一项所述的测定法，其中，所述核酸样本由FFPE肿瘤样本制备。
9.如权利要求1-8中任一项所述的测定法，其中，所述样本包含来自受试者的肿瘤细
胞，所述受试者诊断患有选自于由如下病症所组成的组中的病症：
胃癌、肾癌、胆管瘤、肺癌、脑癌、宫颈癌、结肠癌、头颈部癌、肝细胞瘤、非小细胞肺癌、
黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲状腺癌。
10.如权利要求1-9中任一项所述的测定法，其中，一种或多种所述引物为双结构域引
物。
11.如权利要求1-10中任一项所述的测定法，其中，来自所述引物组的两种以上引物对
的扩增产物为可区分的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的测定法，其中，借助有区别的大小，将来自所述引
物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。
13.如权利要求1-12中任一项所述的测定法，其中，通过用不同的可检测标记物进行标
记，将来自所述引物组的两种以上引物对的扩增产物区分开。
14.如权利要求1-13中任一项所述的测定法，其中，所述引物以约为实施例1的浓度存
在于所述反应混合物中。
15.包含一个或多个引物对的组合物，所述引物对选自于由具有如下序列的分子所组
成的组：
SEQIDNO：1和SEQIDNO：8；SEQIDNO：2和SEQIDNO：8；SEQIDNO：3和SEQIDNO：
8；SEQIDNO：4和SEQIDNO：8；SEQIDNO：5和SEQIDNO：8；SEQIDNO：6和SEQIDNO：8；
SEQIDNO：7和SEQIDNO：8；SEQIDNO：9和SEQIDNO：14；SEQIDNO：10和SEQIDNO：
14；SEQIDNO：11和SEQIDNO：14；SEQIDNO：12和SEQIDNO：14；SEQIDNO：13和SEQID
NO：14；SEQIDNO：15和SEQIDNO：18；SEQIDNO：16和SEQIDNO：18；SEQIDNO：17和SEQ
IDNO：18；SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：利利·I·贡，希兰·马登纳哈利·迪瓦卡，
申请(专利权)人：佳根曼斯菲尔德有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US