一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于高通量测序检测NK细胞多基因变异文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类基因PDGFRA、c‑KIT、STAT3、STAT5B、JAK‑3、PI3K、TP53和K‑ras上的基因突变位点。本发明专利技术的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上淋巴瘤中临床样本基础上需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术具体涉及一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法及其应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(extranodalNK/Tcelllymphoma，nasaltype；N-NK/T-L)是高发于亚洲，尤其是中国的一组与EB病毒感染密切相关的淋巴瘤，现认为活化的NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞可能为其正常对应细胞。目前对该病在临床和组织病理学上已有一些认识，确切诊断需要依据临床、病理、免疫表型特征和分子基础进行综合分析。研究表明NK/T细胞淋巴瘤与PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras基因突变相关，这些基因突变可以作为NK细胞淋巴瘤辅助诊断和用药参考。因此临床上迫切需要一种快速、高通量的检测多基因多位点的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法。本专利技术的另一目的在于提供基于上述构建方法的试剂盒。本专利技术的具体技术方案如下：一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法，覆盖人类基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras上的基因突变位点，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras设计一基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，具体的，该基本扩增引物组包括KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R，其序列依次如SEQID01～SEQID50所示；(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃，具体的，所述不对称连接探针组包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR，其序列依次如SEQID51～SEQID82所示，上述BC1～8分别表示八种不同的标签序列；(3)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将上述扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库；上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述基本扩增引物组由KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R组成。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述不对称连接探针组由Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR组成。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述通用引物为C-primer，其序列如SEQID83所示。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例0.8～1.2∶0.8～1.2∶0.8～1.2。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类基因PDGFRA、c‑KIT、STAT3、STAT5B、JAK‑3、PI3K、TP53和K‑ras上的基因突变位点，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因PDGFRA、c‑KIT、STAT3、STAT5B、JAK‑3、PI3K、TP53和K‑ras设计一基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，具体的，该基本扩增引物组包括KIT‑1‑F、KIT‑1‑R、KIT‑2‑F、KIT‑2‑R、KIT‑3‑F、KIT‑3‑R、KIT‑4‑F、KIT‑4‑R、KIT‑5‑F、KIT‑5‑R、PDG‑1‑F、PDG‑1‑R、PDG‑2‑F、PDG‑2‑R、PDG‑3‑F、PDG‑3‑R、KRAS‑1‑F、KRAS‑1‑R、KRAS‑2‑F、KRAS‑2‑R、KRAS‑3‑F、KRAS‑3‑R、P53‑1‑F、P53‑1‑R、P53‑2‑F、P53‑2‑R、P53‑3‑F、P53‑3‑R、P53‑4‑F、P53‑4‑R、P53‑5‑F、P53‑5‑R、P53‑6‑F、P53‑6‑R、P53‑7‑F、P53‑7‑R、P53‑8‑F、P53‑8‑R、JAK3‑1‑F、JAK3‑1‑R、STAT3‑1‑F、STAT3‑1‑R、STAT3‑2‑F、STAT3‑2‑R、STAT5B‑1‑F、STAT5B‑1‑R、PI‑1‑F、PI‑1‑R、PI‑2‑F和PI‑2‑R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 50所示；(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃，具体的，所述不对称连接探针组包括Ion‑BC1‑FF、Ion‑BC1‑FR、Ion‑BC1‑RF、Ion‑BC1‑RR、Ion‑BC2‑FF、Ion‑BC2‑FR、Ion‑BC2‑RF、Ion‑BC2‑RR、Ion‑BC3‑FF、Ion‑BC3‑FR、Ion‑BC3‑RF、Ion‑BC3‑RR、Ion‑BC4‑FF、Ion‑BC4‑FR、Ion‑BC4‑RF、Ion‑BC4‑RR、Ion‑BC5‑FF、Ion‑BC5‑FR、Ion‑BC5‑RF、Ion‑BC5‑RR、Ion‑BC6‑FF、Ion‑BC6‑FR、Ion‑BC6‑RF、Ion‑BC6‑RR、Ion‑BC7‑FF、Ion‑BC7‑FR、Ion‑BC7‑RF、Ion‑BC7‑RR、Ion‑BC8‑FF、Ion‑BC8‑FR、Ion‑BC8‑RF和Ion‑BC8‑RR，其序列依次如SEQ ID 51～SEQ ID 82所示，上述BC1～8分别表示八种不同的标签序列；(3)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap‑Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将上述扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap‑Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库；上述RingCap‑Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。...

【技术特征摘要】
1.一种用于高通量测序检测的NK细胞多基因变异文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras上的基因突变位点，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因PDGFRA、c-KIT、STAT3、STAT5B、JAK-3、PI3K、TP53和K-ras设计一基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，具体的，该基本扩增引物组包括KIT-1-F、KIT-1-R、KIT-2-F、KIT-2-R、KIT-3-F、KIT-3-R、KIT-4-F、KIT-4-R、KIT-5-F、KIT-5-R、PDG-1-F、PDG-1-R、PDG-2-F、PDG-2-R、PDG-3-F、PDG-3-R、KRAS-1-F、KRAS-1-R、KRAS-2-F、KRAS-2-R、KRAS-3-F、KRAS-3-R、P53-1-F、P53-1-R、P53-2-F、P53-2-R、P53-3-F、P53-3-R、P53-4-F、P53-4-R、P53-5-F、P53-5-R、P53-6-F、P53-6-R、P53-7-F、P53-7-R、P53-8-F、P53-8-R、JAK3-1-F、JAK3-1-R、STAT3-1-F、STAT3-1-R、STAT3-2-F、STAT3-2-R、STAT5B-1-F、STAT5B-1-R、PI-1-F、PI-1-R、PI-2-F和PI-2-R，其序列依次如SEQID01～SEQID50所示；(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃，具体的，所述不对称连接探针组包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF和Ion-BC8-RR，其序列依次如SEQID51～SEQID82所示，上述BC1～8分别表示八种不同的标签序列；(3)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有Ri...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琰，郭飞飞，
申请(专利权)人：厦门飞朔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35