一种磁性复合纳米颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种磁性复合纳米颗粒及其制备方法和应用，该磁性复合纳米颗粒粒径均一，直径40‑60nm，表面通过亲和素‑生物素连接的含脱碱基位点DNA双链可被目标蛋白脱碱基核酸内切酶I(APE1)特异性地识别和切割，释放出荧光基团或药物分子；同时，本发明专利技术所获得的磁性复合纳米颗粒具有良好的分散性、稳定性和生物相容性，从而可用于活细胞内APE1的原位荧光成像。另外由于癌细胞通常过表达APE1，上述磁性复合纳米颗粒可以在癌细胞内更有效地释放药物，有望实现针对癌细胞的精准治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多功能复合纳米颗粒及其制备方法和应用。更具体地说，涉及一种亲和素修饰的核酸功能化磁性复合纳米颗粒及其制备方法和应用。该纳米颗粒可用作基因载体、活细胞内核酸修复酶的原位成像和药物载体，属于纳米颗粒制备

技术介绍
纳米材料具有优良的电学、光学、力学性能，形貌可控且表面易修饰。生物分子具有特异性强、结合位点丰富等特点(EugeniiKatz,ItamarWillner.IntegratedNanoparticle-BiomoleculeHybridSystems:Synthesis,Properties,andApplications.Angew.Chem.Int.Ed(2004),43,6042–6108)。随着纳米技术和生物技术的蓬勃发展，将纳米材料与生物分子相结合制成各种各样的复合纳米材料，可用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织，并在细胞成像、生物传感等方面展现出良好的应用前景。亲和素与生物素之间的结合作用是目前发现的生物分子间最牢固的结合体系(Buller,HR.,Gallus,AS.,Pillion,G.,Prins,MH.,Raskob,GE.Enoxaparinfollowedbyonce-weeklyidrabiotaparinuxversusenoxaparinpluswarfarinforpatientswithacutesymptomaticpulmonaryembolism:arandomised,double-blind,double-dummy,non-inferioritytrial.Lancet(2012),379,123–129)，可以抵抗有机溶剂、表面活性剂、蛋白水解酶、极端的温度和pH的影响等(Green,N.Michael.Avidin.AdvancesinProteinChemistryVolume(1975),29,85-133)。将亲和素与修饰了羧基的硅纳米颗粒共价连接，然后将生物素化的DNA通过亲和素与生物素之间的亲和作用修饰到共价连接了亲和素的硅纳米颗粒表面，可以大大提高纳米颗粒表面DNA的数量，并且增强了DNA与纳米载体的牢固性。DNA或药物转导是指借助外源介导作用将DNA或药物导入到癌细胞或靶细胞中。目前病毒载体虽可以达到较高的转染效率，但存在强免疫原性、高致突变风险、小容量等缺点，限制了其在生物及临床治疗中的应用。而非病毒载体，尤其是纳米颗粒不仅可以克服以上缺点，并且具有合成简便、重复性高、多种物理化学性质和易表面修饰等优点，实现纳米载体的多功能化。磁纳米颗粒不仅易修饰，还具有磁场效应和荧光猝灭效应，将磁纳米颗粒将其他颗粒相结合并修饰上生物分子，便可以解决纳米颗粒分离时间长和转染时间长的问题(Liu,YB.,Fang,SM.,Zhai,JQ.,Zhao,MP.Constructionofantibody-likenanoparticlesforselectiveproteinsequestrationinlivingcells.NANOSCALE(2015),7(16):7162-7167)。硅纳米颗粒不仅具有生物相容性好、多孔性，易反应的优点，还可以保护修饰在纳米颗粒表面的DNA不受DNaseI酶的干扰(Roy,I.,Ohulchanskyy,TY.,Bharali,DJ.,Pudavar,HE.,Mistretta,RA.,Kaur,N.,Prasad,PN.OpticaltrackingoforganicallymodifiedsilicananoparticlesasDNAcarriers:Anonviral,nanomedicineapproachforgenedelivery.PNAS(2005),102(2):279-284)，因此将磁纳米颗粒与硅纳米颗粒相结合，不仅实现了快速高效的转染效率，减少了生物毒性，还保护了被修饰的DNA能够完整的被转染到细胞中。目前已经有的利用硅纳米颗粒将DNA导入细胞的方法，有共价连接DNA(CaiL,ChenZZ,ChenMY,etal.MUC-1aptamer-conjugateddye-dopedsilicananoparticlesforMCF-7cellsdetection[J].Biomaterials,2013,34(2):371-381.)和利用静电相互作用连接(QianR,DingL,JuH.Switchablefluorescentimagingofintracellulartelomeraseactivityusingtelomerase-responsivemesoporoussilicananoparticle.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2013,135(36):13282-13285.)等方法。此类方法主要用于与细胞内miRNA或mRNA的杂交(ZhangP,ChengF,ZhouR,etal.DNA‐hybrid‐gatedmultifunctionalmesoporoussilicananocarriersfordual‐targetedandmicroRNA‐responsivecontrolleddrugdelivery.AngewandteChemieInternationalEdition,2014,53(9):2371-2375.)，由于硅纳米颗粒对DNA的保护作用(HeX,WangK,TanW,etal.BioconjugatednanoparticlesforDNAprotectionfromcleavage.JournaloftheAmericanChemicalSociety,2003,125(24):7168-7169.)，这些纳米颗粒通常都抑制了DNA与细胞内核酸酶的反应，从而难以用于核酸酶的活性分析和原位成像。另外，目前利用纳米颗粒导入miRNA药物，缺乏针对癌细胞特异性的释放调控作用(MuraS,NicolasJ,CouvreurP.Stimuli-responsivenanocarriersfordrugdelivery.Naturematerials,2013,12(11):991-1003.)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种磁性复合纳米颗粒的制备方法和应用。该磁性复合纳米颗粒不仅可以在体外对溶液中的目标蛋白进行特异性的识别和定量分析，更为重要的是，可以在磁场作用下快速地进入活细胞，对其中的目标蛋白进行原位的荧光成像，通过荧光显微镜对其在细胞中的分布进行示踪。若将荧光集团替换为抗癌药物，还可以实现对癌症进行针对性治疗。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种磁性复合纳米颗粒，由内向外依次包括磁核、二氧化硅壳层和生物分子修饰层，所述磁核为铁磁性纳米颗粒，所述二氧化硅壳层为表面修饰有羧基的二氧化硅，所述生物分子修饰层为亲和素及与之(即亲和素)结合的生物素化的含有脱碱基空位的双链DNA(biotinylated-AP-DNA)。进一步地，所述铁磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒或γ-三氧化二铁纳米颗粒。进一步地，所述磁性复合纳米颗粒的TEM粒径为40本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁性复合纳米颗粒，由内向外依次包括磁核、二氧化硅壳层和生物分子修饰层，所述磁核为铁磁性纳米颗粒，所述二氧化硅壳层为表面修饰有羧基的二氧化硅，所述生物分子修饰层为亲和素及与之结合的生物素化的含有脱碱基空位的双链DNA。

【技术特征摘要】
1.一种磁性复合纳米颗粒，由内向外依次包括磁核、二氧化硅壳层和生物分子修饰层，所述磁核为铁磁性纳米颗粒，所述二氧化硅壳层为表面修饰有羧基的二氧化硅，所述生物分子修饰层为亲和素及与之结合的生物素化的含有脱碱基空位的双链DNA。2.如权利要求1所述的磁性复合纳米颗粒，其特征在于，所述铁磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒或γ-三氧化二铁纳米颗粒。3.如权利要求1所述的磁性复合纳米颗粒，其特征在于，所述磁性复合纳米颗粒的TEM粒径为40-60nm，其DLS粒径为65-75nm。4.如权利要求1所述的磁性复合纳米颗粒，其特征在于，所述磁性复合纳米颗粒的表达式为Fe3O4@SiO2@AVD-AP-DNA或γ-Fe2O3@SiO2@AVD-AP-DNA，其中Fe3O4代表四氧化三铁磁核，γ-Fe2O3则代表γ-三氧化二铁磁核；SiO2代表二氧化硅壳层；AVD代表亲和素层；AP-DNA代表生物素化的含有脱碱基空位的双链DNA层。5.如权利要求1所述的磁性复合纳米颗粒，其特征在于，所述生物素化的含有脱碱基空位的双链DNA的两条单链的序列分别为：5’-GGGGACGACTCCATCGACCTCAAGCAGTTGATCCTTTGGAAAAAAA-Biotin-3’和5’-GTCGATGGAGXCGTCCCC-FAM-3’，其中X表示脱碱基位点，Biotin表示生物素标记，FAM为羧基荧光素标记。6.权利要求1-5任意一项所述的磁性复合纳米颗粒的制备方法，包括：先在二氧化硅壳层的外层共价连接上亲和素，然后通过亲和素与生物素的强亲和作用，将生物素化的含U碱基的双链DNA修饰在二氧化硅包覆的铁磁性纳米颗粒表面，最后再利用UDG酶将U碱基切除，产生含...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵美萍，翟筠秋，刘艺斌，黄山，方思敏，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11