一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，包括：PCR反应液，所述PCR反应液包括反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为SEQ ID NO：3。本发明专利技术提供一种操作快速、方法简便、检测特异性好、灵敏度高、检测范围宽的人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，本试剂盒提供的用于靶多核苷酸检测的探针特异性较高，应用该试剂盒，可以对未知样本中的人类免疫性缺陷病毒2型核酸进行快速检测，为诊断人类免疫性缺陷病毒2型核酸提供可靠的实验依据，可以解决现有技术中试剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸检测领域，尤其涉及一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒。
技术介绍
人类获得性免疫缺陷综合症(AIDS，英文全称：acquiredimmunodeficiencysyndrome)，又称艾滋病，其病原是人类免疫缺陷病毒(HIV，英文全称：humanimmunodeficiencyvirus)，属于逆转录病毒科(Retroviridae)的慢病毒亚科(Lentivirinae)。根据其基因型差异分为HIV-1和HIV-2两个大型，各大型包括多种亚型。目前世界上大部分地区流行的是HIV-1，而HIV-2只在西非、西欧区域性流行。HIV基因组由两条单链正链RNA组成，包含gag、pol、env三个结构基因，以及tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、vpx等调控基因，并在基因组的5′端和3′端各含长末端重复序列(LTR，英文全称：longterminalrepeat)。HIV的LTR区含顺式调控序列，包含启动子和增强子并含负调控区，控制病毒基因的表达。各基因的功能如下：(1)gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白(P55)，经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。(2)pol基因编码聚合酶前体蛋白(P34)，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。(3)env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120V3环上，V3环区是包膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。(4)tat基因编码蛋白(P14)可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。(5)rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序列(Crs，英文全称：Cis-Actingrepressionsequance)去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。(6)nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIVcDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感染所必需。(7)vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。(8)vpu基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。(9)vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。HIV-2基因结构与HIV-1存在有差别，两者之间同源性仅为40～60％，HIV-2不含vpu基因，但有一功能不明vpx基因。HIV因为其反转录酶无校正功能，错配性高，导致基因变异性很强，尤以env基因变异率最高。根据env基因区的突变，HIV-2又可分为7个亚型。荧光定量PCR(聚合酶链式反应，英文全称：PolymeraseChainReaction)是在普通PCR的基础上在PCR反应体系中加入荧光基团，在把序列扩增过程中，随着PCR反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加，荧光信号不断增强，并逐渐累积形成一条扩增曲线，通过荧光积累曲线实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性及定量分析的方法。目前real-timeQ-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。(1)扩增序列非特异性检测。此方法基于与DNA结合的荧光分子，如SYBRgreen1等荧光染料。通过在PCR反应体系中加入过量SYBRgreen1荧光染料，此染料能渗入DNA双链，并发出荧光信号，但不能与单链DNA或RNA结合。在模板扩增过程中，随着双链DNA数量的积累，荧光信号强度也等比增强。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA(如引物二聚体)结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线分析的软件加以解决。(2)扩增序列特异性检测。上世纪90年代，TaqDNA多聚酶的5’核酸外切酶活性的发现和双荧光标记探针的运用使得在一密闭PCR反应管中间接地检测PCR产物成为可能，此后，相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中正式投入使用。扩增序列特异性检测又分为直接法和间接法。直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，如分子信标、荧光标记引物及分子探针探针。分子信标探针是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当有与环序列互补的模板存序列存在时，环序列将与模板配对，分子信标将成链状，荧光基团与淬灭剂分开，发出荧光信号。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种：日出引物和蝎子引物。杂交探针使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素，而下游的探针的5′端标记有受体荧光素。在PCR中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移(FRET，此作用与上述水解探针的方式相反)，使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-timeQ-PCR中最广泛使用的TaqMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。HIV-2虽然只是区域性感染，以西非和西欧地区为主，但近年来随着人口流动加强，在其它地区亦出现了感染病例。HIV-2攻击性与HIV-1相比较弱，发展为艾滋病的潜伏期较长，但后期症状类似，危本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒包括：人类免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反应液，所述PCR反应液包括反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为SEQ ID NO：3。

【技术特征摘要】
1.一种人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒包括：人类免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反应液，所述PCR反应液包括反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其中，所述用于靶多核苷酸检测的探针序列为SEQIDNO：3。2.根据权利要求1所述的人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物的序列分别为SEQIDNO：1和2。3.根据权利要求1所述的人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述人类免疫性缺陷病毒2型核酸检测试剂盒还包括内标，所述内标的序列为SEQIDNO：7。4.根据权利要求3所述的人...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，邓中平，龚小鹏，罗惠宾，文荻琛，刘鹏，陈玉保，陈远超，高欢欢，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43