本发明专利技术公开了一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理；（2）构建恒温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明专利技术检测方法中，实验流程少，操作简便易行，消耗费用低，和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本发明专利技术的优势在于通过反转录避免了RNA降解带来结果的不稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种病毒检测方法，具体是一种食品中禽流感病毒的检测方法。
技术介绍
禽流感(Avianinfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种严重危害禽类健康的传染性疾病。禽类感染禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)后,症状可表现为非显性感染、亚临诊感染,或轻度呼吸道疾病、产蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多种形式。根据AIV对易感鸡致病性的差异,可将AIV分为高致病性AIV和低致病性AIV。高致病性AIV(HPAIV)感染禽类所导致的禽流感对养禽业具有毁灭性的打击,故被国际兽疫局规定为A类疾病;而一些低致病性AIV，如H9AIV的感染虽然对感染禽的致死率低,但可引起产蛋量的减少和淘汰率的上升,并造成免疫抑制,引起其他疫病的发生或混合感染，对养禽业造成的经济损失也相当可观。因此,AI一直是威胁世界养禽业的主要疾病之一，世界各国都十分重视对AIV的研究工作。已有研究表明来自于禽类的H9N2禽流感病毒能偶尔从禽类传染给哺乳动物，包括人和猪。Ck/Bei-like和G1-likeH9N2禽流感病毒在1990底首次从人和猪中分离到。2003年分离到的人H9N2禽流感病毒是一个新的重组体，很可能来源于当地的活禽市场。这种跨种间传播表明目前的H9N2禽流感病毒对人仍有潜在的感染性。AIV存在着广泛的抗原漂移和抗原转变现象,其抗原变异频率很高。因此测定AIV的全基因序列，对于研究禽流感病毒的检测、分布、流行规律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重要的意义。本研究分离鉴定了2002-2008年上海地区活禽市场的H9N2亚型禽流感病毒，经全基因序列测定分为三种基因型，对这三种基因型毒株的8个基因片段进行关键位点的分析以及基因进化关系分析，表明这三种基因型与目前报道的基因型存在差异，为H9N2禽流感病毒Ck/Bei系中的三种新的基因型，分别命名为Y1,Y2,Y3。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种结构简单、使用方便的食品中禽流感病毒的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36-38℃，培养时间为6-8h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板4μL，SYBERGreenI荧光染料0.3μL，10×Buffer2.0μL，DNA聚合酶10U，甲酸甲酯溶液0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液1μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述SYBERGreenI荧光染料为10-20倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、松油醇；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述甲酸甲酯溶液的浓度为8-14mmol/L；所述磺酸钠溶液的浓度为5-10mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述硬脂酸锌溶液的浓度为20-40mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，90-93℃变性0.5-1.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（1）中培养温度为37℃，培养时间为7h。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述SYBERGreenI荧光染料为15倍稀释。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述甲酸甲酯溶液的浓度为11mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述磺酸钠溶液的浓度为8mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述硬脂酸锌溶液的浓度为30mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（3）中92℃变性1.0min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术检测方法中，实验流程少，操作简便易行，消耗费用低，和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本专利技术的优势在于通过反转录避免了RNA降解带来结果的不稳定性。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。实施例1一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36℃，培养时间为6h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板4μL，SYBERGreenI荧光染料0.3μL，10×Buffer2.0μL，DNA聚合酶10U，甲酸甲酯溶液0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液1μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；所述SYBERGreenI荧光染料为10倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、松油醇；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述甲酸甲酯溶液的浓度为8mmol/L；所述磺酸钠溶液的浓度为5mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；所述硬脂酸锌溶液的浓度为20mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，90℃变性0.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。实施例2一种食品中禽流感病毒的检测方法，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36℃，培养时间为6h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板4μL，SYBERGreenI荧光染料0.3μL，10×Buffer2.0μL，DNA聚合酶10U，甲酸甲酯溶液0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液1μL，其余本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36‑38℃，培养时间为6‑8h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板 4μL，SYBER Green I荧光染料 0.3μL，10×Buffer 2.0μL，DNA聚合酶 10U，甲酸甲酯溶液 0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液 1μL，其余用dd H2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述SYBER Green I荧光染料为10‑20倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris‑HCl（pH 8.3）、松油醇；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述甲酸甲酯溶液的浓度为8‑14mmol/L；所述磺酸钠溶液的浓度为5‑10mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7‑1.9；所述硬脂酸锌溶液的浓度为20‑40mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，90‑93℃变性0.5‑1.5min；60℃退火45s；72℃延伸1min；38个循环，最后72℃延伸15min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。...
【技术特征摘要】
1.一种食品中禽流感病毒的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以禽流感病毒HA、AIV基因特异序列为靶序列，SYBERGreenI为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品通过生理盐水进行清洗，随后转移到鸡胚中进行培养，培养温度为36-38℃，培养时间为6-8h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总RNA,随后进行反转录，制得DNA；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板4μL，SYBERGreenI荧光染料0.3μL，10×Buffer2.0μL，DNA聚合酶10U，甲酸甲酯溶液0.5μL，磺酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物3μL，柠檬酸裂合酶4μL，硬脂酸锌溶液1μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述SYBERGreenI荧光染料为10-20倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、松油醇；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述甲酸甲酯溶液的浓度为8-14mmol/L；所述磺酸钠溶液的浓度为5-10mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述硬脂酸锌溶液的浓度为20-40mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敏芳，徐静，赵春城，胡勇，蒋韦艳，刘金杰，
申请(专利权)人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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